實時熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光集團，利用熒光信號來實時監(jiān)測整個PCR進程，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板濃度進行定量分析。
其特點有：
(1)用產(chǎn)生熒光信號的指示劑顯示擴增產(chǎn)物的量，進行實時動態(tài)連續(xù)的熒光監(jiān)測，避免終點定量的不準(zhǔn)確性，并且消除了標(biāo)本和產(chǎn)物的污染，且無復(fù)雜的產(chǎn)物后續(xù)處理過程。
(2)熒光信號通過熒光染料嵌入雙鏈DNA，或熒光探針特異結(jié)合木得檢測物等方法獲得，打打提高了檢測的靈敏度、特異性和精確性。Real-timeO-PCR可以應(yīng)用于mRNA表達(dá)的研究、DNA拷貝數(shù)的檢測、單核苷酸多態(tài)性的測定、細(xì)胞因子的表達(dá)分析、腫瘤耐藥基因表達(dá)的研究以及病毒感染的定量監(jiān)測。
實時熒光定量PCR技術(shù)的基本原理
在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光基團，這些熒光物質(zhì)有其特定的波長。儀器可以自動檢出，利用熒光信號積累，實時監(jiān)測整個PCR進程，在PCR循環(huán)中，測量的信號將作為熒光閾值的坐標(biāo)。并且引入一個——Ct值（Thresholdcycle）概念，Ct值是指產(chǎn)生可被檢測到得熒光信號所需的小循環(huán)數(shù)，是在PCR循環(huán)過程中熒光信號由本底開始進入指數(shù)增長階段的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。
熒光閾值相當(dāng)于基線熒光信號的平均信號標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。一般認(rèn)為在熒光閾值以上所測出的熒光信號是一個可信的信號，可以用于定義一個樣本的Ct值。通常用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品的Ct值來產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計算相對方程式。
方程式的斜度可以用來檢查PCR的效率，所有標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸分析需要存在一個高相關(guān)系數(shù)（R²＞0.99），這樣才能認(rèn)為實驗的過程和數(shù)據(jù)是可信的，使用這個方程式計算出未知樣本的初始模板量。實時熒光定量PCR儀都有軟件，可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線中自動地計算出未知樣本的初始模板量。
實時熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用
1.基因工程研究領(lǐng)域
①基因表達(dá)研究：對β地中海貧血癥患者β與γ珠蛋白mRNA水平進行檢測，其結(jié)果特異性強、定量準(zhǔn)確，為了解β地中海貧血的分子病理機制及其臨床診斷提供了可靠的檢測數(shù)據(jù)。
②轉(zhuǎn)基因研究：利用兩種發(fā)光探針及適當(dāng)?shù)难h(huán)閾值，擴增一個轉(zhuǎn)移后的基因和一個對照基因，以分析轉(zhuǎn)基因老鼠接合性。該方法為45個轉(zhuǎn)基因動物的同型結(jié)合及異質(zhì)結(jié)合提供了明確的鑒定結(jié)果。通過實時定量PCR檢測，同型結(jié)合的異質(zhì)接合動物交配后其子代中轉(zhuǎn)基因的傳遞情況符合孟德爾遺傳規(guī)律。這項技術(shù)在轉(zhuǎn)基因動物繁育及基因劑量功能效應(yīng)實驗中將有很大的用途。
③單核苷酸多態(tài)性（SNP）及突變分析：實時熒光定量PCR一個誘人的應(yīng)用前景是用于檢測基于兩條探針和基因組的不穩(wěn)定性。基因突變基于兩條探針，一條探針橫跨突變點，另一條為錨定探針，與無突變位點的靶序列雜交。兩條探針用兩種不同的發(fā)光基團標(biāo)記。如靶序列中無突變，探針雜交便*配對，如有突變，則探針與靶序列不*配對，會降低雜交體得穩(wěn)定性，從而降低其熔解溫度（Tm）。這樣便可對突變和多態(tài)性進行分析。
2.醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域
①病原體檢測：由于實時熒光定量PCR方法可靠性和重復(fù)性好，并且操作簡便、快速、結(jié)果判斷客觀，目前，人們用此方法對人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、結(jié)核桿菌、巨細(xì)胞病毒、EB病毒、流感病毒A、流感病毒B等病原體的檢測。熒光定量PCR問世后的幾年中，積累了大量有關(guān)病原體核酸量與感染性疾病發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后之間關(guān)系的資料，這些研究資料不斷豐富，將形成感染性疾病的臨床分子診斷標(biāo)準(zhǔn)。
②藥物療效考核：利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測臨床樣品中與抗藥性相關(guān)的基因的表達(dá)。結(jié)果證明，實時熒光定量PCR系統(tǒng)是定量檢測抗藥基因表達(dá)的可靠方法，應(yīng)用這種技術(shù)可以預(yù)測化療將引起的反應(yīng)。
③腫瘤基因檢測：腫瘤的本質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)基因發(fā)生了變化，是一種多基因異常的疾病，這些異常變化用實時熒光定量PCR方法都可以檢測出來。目前用此方法進行過端粒酶hTERT基因、慢性粒細(xì)胞性白血病bcr/abl融合基因、腫瘤MDRI基因、白血病WTI基因、腫瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關(guān)的病毒基因等多種基因的表達(dá)檢測。隨著與腫瘤相關(guān)的新基因的不斷發(fā)現(xiàn)。熒光定量PCR技術(shù)將會在腫瘤的研究中發(fā)揮更大的作用。
3.其他領(lǐng)域
用實時熒光定量PCR方法對免疫組分進行分析是其應(yīng)用的重要方面。
