數(shù)字PCR實操結(jié)果及體會的特異性！ 導讀：多年來，研究人員一直缺乏工具，來高效拷問這些差異，不過今非昔比。有了新一代DNA測序儀和質(zhì)譜儀，研究人員能夠以更高的分辨率、深度和通量來探索各個細胞之間的差異，特別是在單細胞轉(zhuǎn)錄組水平。
將細胞培養(yǎng)板上的細胞放在顯微鏡下觀察。表面上，它們都一樣。實際上，它們一點都不相同。無論是DNA或RNA的水平，還是蛋白質(zhì)或代謝物的水平，這些細胞相差甚遠，而這些差異可能對細胞行為產(chǎn)生深遠的影響。
多年來，研究人員一直缺乏工具，來高效拷問這些差異，不過今非昔比。有了新一代DNA測序儀和質(zhì)譜儀，研究人員能夠以更高的分辨率、深度和通量來探索各個細胞之間的差異，特別是在單細胞轉(zhuǎn)錄組水平。
單細胞捕獲
目前，人們通常采用三種方法來分離單細胞。一種是熒光激活細胞分選（FACS），其中帶有特定熒光標記的細胞才會激活熒光檢測器。這些細胞隨后進入收集板中，每個細胞占一個孔，而其余的細胞被丟棄。
據(jù)BDBiosciences的生物科學副總裁RobertBalderas介紹，F(xiàn)ACS在單細胞分離上實現(xiàn)了其他方法的控制水平，這要歸功于不同顏色帶來的高分辨率。“這是一種二元的方法。如果有兩種顏色和兩種抗體，那么有四種可能性；如果是20種顏色，那么有220萬個組合，”他說。
近，Broad研究院的LeviGarraway及其同事就采用了一種簡單的方案，利用CD45的表達和細胞活力來分析人黑色素瘤中4645個腫瘤、免疫和基質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)錄組3。
BDBiosciences的款儀器，F(xiàn)ACSymphonyA5細胞分析儀，提供了50個通道的分辨率（48種顏色再加正向和側(cè)向散射），理論上有1.1萬億個組合。據(jù)Balderas介紹，目前研究人員已利用這個平臺來區(qū)分30個通道，而40色的panel應該很快面世。
單細胞分離的另一種方法是顯微操作，它利用玻璃微針，每次捕獲一個細胞，并轉(zhuǎn)移到目的容器中。這個過程可手動開展，或通過自動化系統(tǒng)開展，適合低復雜度的樣品，但略顯沉悶。
一個選擇是微流體，比如Fluidigm的C1單細胞制備系統(tǒng)。與的Single-CellmRNASeqHT芯片相結(jié)合，C1可平行捕獲800個細胞，并開展RNA分離和cDNA合成。這家公司的Polaris™系統(tǒng)也具有捕獲、培養(yǎng)、刺激和制備樣品的能力，可平行處理48個細胞，從而使研究人員能夠探索單個細胞的功能。
文獻中也經(jīng)常報道新的微流體設(shè)計。今年1月，麻省理工學院的ScottManalis及其同事介紹了一種微流體“流體力學捕獲芯片”，能夠捕獲和培養(yǎng)細胞；之后隨著免疫細胞的生長和分裂，比較各代之間的轉(zhuǎn)錄變化1。
在分離出單個細胞后，研究人員可采用多種工具來定量基因表達水平。就目前而言，的也許是單細胞RNA-Seq，或者它的衍生形式–單核RNA-Seq，其中單個細胞核被分離出來并測序2。
下一步分析
10XGenomics公司近在BioRxiv預印本網(wǎng)站上介紹了一種特別高通量的RNA-Seq方法。它基于GemCode技術(shù)，可以對每個樣品中數(shù)萬個單細胞的3’mRNA進行計數(shù)。這家公司用它來分析68000個外周血單核細胞，并根據(jù)其轉(zhuǎn)錄特征來分級，檢測到所有預期的細胞種類（如T細胞、B細胞和自然殺傷細胞等）。
另一種流行的方法是單細胞qPCR。當然，研究人員也經(jīng)常用RNA原位雜交及相關(guān)方法。AdvancedCellDiagnostics的醫(yī)療官RobMonroe認為，在驗證RNA-Seq和PCR表達分析時，RNAISH特別有用，因為它在細節(jié)上的優(yōu)勢彌補了通量上的不足。
RNAISH“沒有新一代測序的通量或多重分析能力”，Monroe說。“不過你獲得的東西也同樣重要：它們能夠看到RNA在組織背景、細胞的形態(tài)學背景以及周圍組織中的表達。”
AdvancedCellDiagnostics的RNAscope是一種新型的RNAISH技術(shù)。兩條相鄰的“Z探針”在特定轉(zhuǎn)錄本上雜交，為高度分支的檢測探針樹的組裝提供了支架，這實現(xiàn)了信號放大。Monroe表示，單次結(jié)合可作為400個探針分子的支架，從而使信號放大400倍。利用顯色試劑可拷問兩個不同的RNA目標，而利用熒光試劑可拷問三個。
的華裔學者、哈佛大學的莊小威教授將RNAISH延伸到每個細胞中的1000個轉(zhuǎn)錄本。她的團隊開發(fā)出一種名為MERFISH（多重容錯熒光原位雜交）的方法，為每個轉(zhuǎn)錄本分配一個*的16位條形碼，然后通過一系列雜交、成像和淬滅的步驟來讀取4。
在一篇發(fā)表于《NatureMethods》的評論文章中，賓夕法尼亞大學的JimEberwine及其同事寫道，“盡管單細胞測序讓人們無比興奮，但它仍不是一種常規(guī)的實驗操作。基本技術(shù)以及數(shù)據(jù)分析和解釋的改進對精確測定很重要，同時需要大樣本量來了解單個細胞的作用”5。
其他的單細胞方法也是如此。隨著文獻中出現(xiàn)越來越多的改進，相信更多的研究人員會踏上單細胞分析之路。隨之而來的，將是更多隱藏在大規(guī)模培養(yǎng)物背后的生物學秘密被揭開。
