實驗背景
細胞三磷酸腺苷(ATP)的產生速率是一種描述細胞代謝的信息含量很高的測量,因為
ATP是細胞內普遍存在的主要能量貨幣。細胞的代謝調控使細胞根據ATP需求的變化調整ATP產生的變化來維持總的細胞內的ATP水平。
安捷倫Seahorse XF實時ATP速率測定被設計用來測量活細胞總的ATP產生速率。更重要的是,這個實驗能夠區分哺乳動物細胞內兩條主要的產生ATP的代謝途徑線粒體氧化磷酸化(OXPHOS)和糖酵解ATP的產生。
常見問題
如果檢測液中含有不同的氧化底物(不同的P/O值),mitoATP產生速率如何計算?
為了將ATP偶聯的呼吸轉換為線粒體的ATP產生速率,在電子傳遞鏈末端每還原一個氧原子,ADP磷酸化為ATP的化學計量學必須得到確定。不同的底物理論上最大的P/O值不同,并且依賴于化學計量學/底物氧化通路,以及F1F0 ATP合酶的效率。在標準的XF實驗條件下,細胞被供給底物混合物(主要是葡萄糖,丙酮酸和谷氨酰胺),且通常內源性底物儲備(糖原,脂肪酸,其他氨基酸)可用于線粒體氧化。因此,用幾種細胞系進行了測試并確認P/O值2.75準確代表了外源性和內外源性氧化底物混合物的平均P/O值。
當進行誘導的XF實時ATP速率測定時,誘導的速率是如何計算和報告的?
在XF實時ATP速率誘導實驗中Summary Printout和Measure Sheet中的 Average Assay Parameter Calculations顯示的Induced Rate(s)是用急性注射和寡霉素注射之間所有測量的平均值計算的。然而,每個時間點的誘導速率可以從Kinetic Rate Data(Measure Sheet)中獲得。
XF實時ATP速率測定中定義的XF ATP速率指數是什么?
XF ATP速率指數是mitoATP產生速率與glycoATP產生速率的比值(即mitoATP rate/glycoATP rate)。這個比值是一個細胞代謝表型的定量指標。代謝指數大于1代表大于50%的細胞ATP來自線粒體的ETC/氧化磷酸化,而指數小于1表示大于50%的總ATP是糖酵解途徑產生的。因為代謝指數是比值測量,所以它對于代謝表型的改變或轉換是高度敏感的。
為什么相同的細胞類型當細胞以不同的密度種板時XF ATP速率不一樣?
細胞的代謝表型會被細胞對ATP的需求所影響。一般來說,處于增殖或分化中的細胞比融合(緩慢生長)或末端分化的細胞擁有更高的糖酵解速率。為了比較實驗之間的結果,推薦在整個研究過程中保持一致的細胞培養條件和細胞接種密度。
為什么必須用Seahorse XF DMEM培養基,pH 7.4或Seahorse XF RPMI培養基,pH 7.4來進行這個實驗?
GlycoATP產生速率的計算需要對XF實時ATP速率測定中的糖酵解質子流出速率進行絕對測量。為了正確計算PER,檢測液必須要有一個固定的緩沖能力。培養基中低濃度的HEPES 在實驗的時間范圍內提供了一致的緩沖能力值。雖然添加HEPES緩沖液輕微地減少了ECAR信號,但是它顯著提高了ECAR數據的質量和一致性,以及轉換為PER的準確性(更多詳情,請參閱White paper: Improving Quantification of Cellular Glycolytic Rate Using Agilent Seahorse XF Technology)。此外,使用預調pH到7.4的XF DMEM或XF RPMI培養基節省了實驗準備的時間,確保XF實驗過程中一致的檢測液pH值。
我能夠使用其他的Seahorse XF檢測液來運行XF實時ATP速率測定嗎?
GlycoATP產生速率的準確計算需要使用一種沒有酚紅和碳酸氫鈉且低濃度HEPES緩沖液的檢測液。因此,強烈推薦使用安捷倫Seahorse XF DMEM(或RPMI),pH 7.4的培養基。任何偏離推薦的培養基和補充劑(葡萄糖,丙酮酸鈉,谷氨酰胺),需要根據經驗(使用XF分析儀)確定每個實驗的緩沖系數(參閱Seahorse XF Buffer Factor Protocol以進一步了解信息)。任何含有酚紅的檢測液不能在XF實時ATP速率測定中使用。
當運行誘導的XF實時ATP速率測定時,寡霉素注射之后的OCR高于基礎OCR,發生了什么?
在寡霉素注射之前加入的化合物使電子傳遞與氧化磷酸化解偶聯(如FCCP,DNP等等),通常會導致OCR增加。然而,這種呼吸不與ATP的產生偶聯,因為沒有ATP合酶的參與,線粒體膜電位會減少或消除,所以在這種環境下很少或沒有ATP生成。在這些情況下,基礎的mitoATP產生速率不能夠被準確計算。如果懷疑存在解偶聯化合物,那么推薦添加一組對照組,注射檢測液+溶劑來計算基礎的mitoATP產生速率。
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