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什么是樹突狀細胞（DC）？
DC細胞是“Dendritic Cell"，中文名稱是樹突狀細胞。樹突狀細胞是人體內有效的抗原遞呈細胞（antigen presenting cell, APC）。DC細胞是能夠顯著刺激初始T細胞增值的APC，其他種類的APC（如單核巨噬細胞，B細胞等）僅能刺激已活化的或者記憶性的T細胞，因此DC細胞是適應性T細胞免疫應答的始動者，在腫瘤免疫中發揮著及其重要的作用。
DC 表面高表達MHC -I和MHC -II類分子，具有特異性表面標志的細胞。其對抗原攝取，加工以及刺激T細胞使其激活，并最終決定T細胞的分化方向。
圖1.DC-T 細胞相互作用[1]
DC提供三個關鍵信號來激活初始 T 細胞并啟動適應性免疫反應：
首先
DC 表面 p-MHC 復合物被抗原特異性 T 細胞受體 (TCR) 識別。
其次
共刺激相互作用發生在 DC CD80/CD86 分子和 T 細胞 CD28 分子之間。T 細胞還可能表達 CTLA-4 分子，該分子與 DC CD80/CD86 相互作用并傳遞抑制 T 細胞激活的信號。
最后
局部細胞因子的存在，活化的T 細胞可能最終分化為幾種特殊亞型之一。其中包括 Th1、Th2、Th17 和 Treg 譜系。Th1、Th2 和 Th17 構成 T 細胞反應的“激活"臂，Treg 細胞形成“抑制"臂。
IL-12 刺激 Th1 細胞分化，產生 IFN-g，這是先天性和適應性免疫反應的重要激活劑，IL-4抑制Th1細胞的分化。IL-4促進Th2細胞的分化，Th2細胞分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13，激活嗜酸性粒細胞、肥大細胞和B細胞以支持體液免疫和寄生蟲抵抗力。IFN-g 抑制 Th2 分化。Th17 細胞在 TGF-β和 IL-6 或 IL-21 存在的情況下發育。它們分泌 IL-17、IL-17F、IL-21 和 IL-22，在自身免疫組織炎癥和對細胞外細菌感染的抵抗力的發展中發揮關鍵作用。TGF-β的存在促進調節性 T 細胞的發育。p-MHC-TCR 或共刺激相互作用（可能通過未成熟 DC 的抗原呈遞發生）以及通過 DC 共抑制分子或 CTLA-4 激活傳遞抑制信號也可能誘導Treg 細胞分化。IL-6 抑制Treg細胞發育。Tregs分泌IL-10和TGF-β來抑制免疫反應。
DC的來源
DC細胞在體內含量甚微, 從體內直接分離出DC耗時而且細胞產量很低，這極大地限制了DC的研究和應用。但DC能從不同組織里的DC前體細胞分化、誘導而來, 如骨髓液的前體細胞，外周血和臍帶血的單核細胞。
對于人，由于人外周血的取材最為方便且單核細胞數量最多，所以常用的方法是從人外周血單個核細胞(PBMC)誘導DC。而對于小鼠，最常見的方法是從骨髓細胞誘導產生DC，即骨髓來源的DC(Bone Marrow-Derived Dendritic Cells，BMDC)。
DC分類
根據DC發育成熟狀態，分為不同成熟階段
Step1
從DC的祖細胞（如單核細胞）誘導分化為未成熟DC（immature DC，iDC）
Step2
從iDC誘導分化為成熟DC (mature DC，mDC)
圖2.DC細胞分類[2]
iDC和mDC的作用
DC的不同成熟狀態決定了其在免疫應答中的作用，iDC具有很強的抗原攝取和加工能力。但抗原遞呈能力很弱，不能活化T細胞。在體外培養時，iDC 去除細胞因子(即 GM-CSF 和 IL-4)后，會逆轉為巨噬細胞。MHC -II類分子和共刺激分子CD80、CD86和CD40是DC成熟程度的指標。未成熟的DC低表達MHC -II類分子和共刺激分子CD80、CD86和CD40等。
成熟DC則正好相反，其抗原攝取和加工能力很弱，但具有很強的抗原遞呈能力。因而可以激活 T 細胞，引起免疫反應。而且 DC 成熟后即使在培養體系中去除細胞因子，仍能保持 DC 的狀態和功能，不會發生逆轉。因此DC 必須成熟后才能用于免疫治療。
DC培養原理
人源DC的培養主要是由外周血單核細胞與不同的細胞因子組合進行定向誘導產生。目前誘導DC產生的細胞因子組合有多種，如IL-4聯合GM-CSF、TNF-α聯合GM-CSF、IFN-α聯合GM- CSF、IL-15聯合GM-CSF、單獨TSLP進行誘導等，由此產生的DC特性也各不相同。DC的前體細胞來源不同，采用的細胞因子組合也不盡相同。目前人源DC常用的方法是GM-CSF聯合IL-4誘導外周血單核細胞產生DC。
細胞因子的作用
GM-CSF和IL-4共同作用可使單核細胞定向分化為未成熟DC。TNF-α/IL-1β/IL-6 三因子組合可在無牛血清培養條件下誘導DC的全成熟，從而制備出DC。
圖3. 人外周單核細胞來源的樹突狀細胞（MoDC）制備方法簡圖
Step1:
GM-CSF (粒細胞巨噬細胞集落刺激因子）
(1)GM-CSF是一種造血生長因子，在體外可刺激中性粒細胞和巨噬細胞集落的形成，并具有促進早期紅巨核細胞、嗜酸性祖細胞增殖和發育的功能；
(2)GM-CSF是常用的DC細胞培養因子之一；
(3)它能夠誘導單核細胞或DC前體細胞向DC分化，并促進DC的增殖和存活；
(4)GM-CSF還可以提高DC表面抗原水平，增強DC的抗原捕獲和處理能力。
1. IL-4 (白細胞介素-4)
（1）單核細胞可分化為巨噬細胞、破骨細胞 (OC) 和樹突狀細胞 (DC)。
（2）IL-4 抑制單核細胞向CD14+巨噬細胞分化，從而誘導其分化為未成熟DC。若培養體系中不加 IL-4，單核細胞將分化為巨噬細胞。
（3）IL-4能夠促使DC產生Th2型免疫反應相關的細胞因子，如IL-10和IL-13。
（4）IL-4 還可影響DC的表面標志物表達，使其具有更好的抗原遞呈和T細胞活化能力。
GM-CSF和IL-4 共同作用可使單核細胞定向分化為未成熟DC，此時的DC具有較強的抗原攝取和加工能力，但抗原遞呈能力很弱。細胞表面中度表達 MHC I 類、II 類分子和 B7 家族分子(CD80, CD86 等)，但不表達或低表達CD14。
Step2:
TNF-α (腫瘤壞死因子-α）
TNF-α是一種早期炎癥細胞因子，能夠促使DC的分化和成熟，并增強其抗原遞呈能力。它還能夠激活NF-κB信號通路，促進DC產生其他炎癥介質和細胞因子。
IL-1 (白介素-1)
(1)IL-1是一種早期炎癥細胞因子，包括IL-1α和IL-1β兩個亞型。
(2)在DC細胞培養中，IL-1β能夠促進DC的分化和成熟。
(3)IL-1β刺激DC表達更多的共刺激分子（如CD40、CD80和CD86），增強其抗原遞呈和T細胞活化能力。
(4)此外，IL-1也可以促進DC產生其他炎癥細胞因子，如IL-12和TNF-α等。
IL-6 (白介素-6)
(1)IL-6是一種具有多種生物學功能的細胞因子。在DC細胞培養中，IL-6起著雙重作用。
(2)一方面，IL-6可以促進DC的分化和成熟，提高其抗原遞呈能力。
(3)另一方面，IL-6還可以影響DC的功能，如調節其分泌的細胞因子類型和數量。
(4)IL-6還可以調控DC與其他免疫細胞之間的相互作用，如與T細胞的活化和極化。
這 3 種細胞因子均可下調未成熟DC的巨胞飲作用和表面Fc受體的表達，使細胞內MHC II類分子區室消失，但能夠上調細胞表面 MHC I類、II 類分子和B7家族分子(CD80, CD86 等)的表達，使未成熟DC分化為成熟DC，此時DC的抗原攝取和加工能力明顯減弱，而抗原遞呈能力顯著增強，可地激活 T細胞。TNF-α,IL-1β和IL-6三因子組合可在無牛血清培養條件下誘導 DC 的成熟，從而制備出DC。
PGE2 (前列腺素 E2)
在 TNF-α，IL-1β、IL-6 成熟誘導組合中添加 PGE2，可進一步提高 DC 的產量、成熟度、遷移能力和免疫激活能力。DC 遷移能力的提高非常重要。因為TNF-α，IL-1β、IL-6 誘導成熟的DC遷移能力較弱，不能很好地到達淋巴結而激活T細胞。而添加PGE2后誘導成熟的DC因表面趨化因子受體的高表達，而更容易遷移至淋巴結，進而引起機體對抗腫瘤的免疫反應。
因此，TNF-α/IL-1β /IL-6/PGE2 組合廣泛應用于臨床，并被認為是制備成熟DC 的“金標準"。
各細胞因子使用濃度
請根據具體實驗目的、細胞類型和培養條件進行優化，以確定適合自己實驗需求的最佳濃度，表1中濃度僅供參考。
表1. 各細胞因子工作濃度
組分 | 工作濃度 |
Human GM-CSF | 500-1000 U/mL (50-100 ng/mL) |
Human IL-4 | 250-500 U/mL (50-100 ng/mL) |
Human TNF-α | 10 ng/mL |
Human IL-1β | 10 ng/mL |
Human IL-6 | 10-100 ng/mL |
PGE2 | 1 μg/mL |
人外周血單核細胞來源樹突狀細胞（MoDC）的制備
外周血單核細胞的采集
1.1 用血細胞分離機采集患者自身的外周血單個核細胞 80-100mL；
1.2 淋巴細胞分離液密度梯度離心法進一步純化單個核細胞(PBMC)。
1.3 無血清培養液洗滌2次，獲得純度在90%以上的 PBMC，細胞數量需達到（1-3）×108。
DC前體細胞培養
2.1 PBMC用培養基懸浮細胞，并調整細胞濃度至3×106/mL，并接種于培養板中；
2.2 37℃，5% CO2 培養箱中孵育2h，吸棄培養上清，用培養基輕輕洗培養板以去除非貼壁細胞，即獲得貼壁的單核細胞；
2.3 在貼壁細胞中加入含重組人GM-CSF(500-1,000U/mL)和重組人 IL-4(500U/mL)的培養基，37℃，5% CO2 培養箱中培養，誘導單核細胞向DC細胞分化；
2.4 每 2-3d 半量換液一次，并補足人 GM-CSF和IL-4；
2.5 在培養的第 6d，加入重組人 TNF-α(10-20 ng/mL)，IL-1β(10ng/mL)，IL-6(1000U/mL)和PGE2(1μg/mL)，誘導DC細胞成熟；
2.6 在培養的第 7d 或第 8d，收獲 DC 細胞，其數量應達到 1×106 個以上；
DC 的質檢
在培養過程中可進行細胞形態學觀察和細胞活力檢測。
3.1 活細胞比例：
臺盼藍染色驗證活細胞應在 90%以上；
3.2 形態學觀察：
>90%細胞半懸浮，細胞有多個樹突樣突起；
3.3 細胞表型分析：
流式細胞術檢測 DC特異性表面標志物， CD14、HLA-DR、HLA-ABC、CD40、CD80、CD83 和 CD86 等分子的表達，成熟的DC不表達 CD14，而高表達其他分子。CD83 是成熟 DC 的特異性標志，在單核細胞和不成熟DC 表面不表達或低表達。
3.4 無菌檢測：
收獲細胞前取少量培養物進行細菌、真菌培養，并檢測支原體、衣原體，均應為陰性；
3.5 內毒素檢測：
收獲細胞前取少量培養物，回輸前，用鱟試劑檢測內毒素含量，標準：內毒素<0.5 EU/ml。
3.6 抗原吸收能力檢測：
使用dextran（葡聚糖）作為抗原，可以評估MoDC細胞的抗原吸收能力。收集單核細胞，不成熟DC和成熟DC，分別按1×105 cells/mL懸于全培養基，再加入FITC-dextran（1 mg/mL），在37°C下，孵育0、5、10、20、30和60分鐘。所有樣品在冰上保持60分鐘。60分鐘后，使用含有1%胎牛血清的冰PBS洗滌所有樣品兩次（以300×g離心，5分鐘，4°C），最后懸浮于含有0.5%BSA的PBS中。樣品保持在冰上直到流式細胞術分析。通過流式細胞術測量FITC的平均熒光強度（MFI）來測定FITC-dextran的攝取。
3.7 成熟MoDC的遷移能力
Transwell實驗：將mMo DC重懸于含有10%FCS的培養基中，密度5×105細胞/mL，取200µL在Transwell板的上部隔間中。下部隔室加滿600µL含有重組人CCL19的培養基，重組人CCL19配制梯度濃度，檢測不同濃度下 MoDC的遷移能力。3小時后，收獲下隔室中包含的細胞，并計數。
3.8 MoDC誘導混合淋巴細胞增殖反應（MLR）
iDC在攝入抗原后，逐漸成熟并遷移到T淋巴細胞區域，遞呈抗原刺激T細胞增殖引發免疫反應。 準備5×10? CD4+T細胞懸浮在400µL PBS中，并用熒光染料標記T細胞。隨后，細胞清洗3次。最后，將CD4+T細胞懸浮在MLR中，密度為5×10? cells/mL。
懸浮單核細胞、imMo-DCs和mMo-DCs于MLR中,在密度為1×10? cells/mL，并根據表2連續稀釋。將不同的細胞稀釋液（每孔100µL）置于96孔板中。隨后，加入標記的T細胞（每孔100µL），并在37℃、5% CO2下培養7天。CD4+T細胞的增殖通過測量流式細胞術檢測。
表2. Mo-DC/monocyte 連續稀釋
Mo-DC/monocyte density (cells/mL) | Number of Mo-DCs/monocytes per well | Ratio of Mo-DCs/monocytes to T cells |
2.5×105 | 25000 | 1:2 |
1.25×105 | 12500 | 1:4 |
6.25×104 | 6250 | 1:8 |
3.13×104 | 3125 | 1:16 |
1.56×104 | 1562 | 1:32 |
7.81×103 | 781 | 1:64 |
DC培養試劑推薦
產品名稱 | 貨號 | 規格 | 價格(元） | 促價(元） |
Human GM-CSF | 91102ES | 5μg/50μg/100μg/500μg | 535/3215/5145/14405 | 268/1608/2573/7203 |
Mouse GM-CSF | 91108ES | 5μg/50μg/100μg/500μg | 535/3265/4985/13465 | 268/1633/2493/6733 |
Human IL-4 | 90105ES | 5μg/50μg/100μg/500μg | 535/3215/5145/12865 | 268/1608/2573/6433 |
Mouse IL-4 | 90144ES | 5μg/50μg/100μg/500μg | 535/3215/5144/14405 | 268/1608/2572/7203 |
Human TNF-α | 90601ES | 10μg/100μg/500μg | 815/2985/9985 | 408/1493/4993 |
Mouse TNF-α | 90621ES | 5μg/20μg/50μg/500μg | 535/1605/3695/5545 | 268/803/1848/2273 |
Human IL-1β | 90101ES | 2μg/10μg/50μg/100μg | 535/1855/5565/8905 | 268/928/2783/4453 |
Mouse?IL-1β | 90140ES | 2μg/10μg/50μg/100μg | 535/1855/3855/5785 | 268/928/1928/2893 |
Human IL-6 | 90107ES | 5μg/20μg/50μg/100μg | 585/1755/3165/4755 | 293/878/1583/2378 |
Mouse?IL-6 | 90146ES | 2μg/10μg/50μg/100μg | 535/1855/3855/5395 | 268/928/1928/2698 |
PGE2 | 60810ES03 | 1 mg | 545 | 436 |
產品特點
翌圣生物提供一系列與樹突狀細胞培養相關的HiActive®高活性細胞因子產品，以支持DC研究。
HiActive®高活性細胞因子: 每個細胞因子生物活性均經過驗證，保證細胞因子的高活性。
活性驗證：
Human GM-CSF
Figure 4. The ED50 as determined by a cell proliferation assay using human TF-1 cells is less than 0.1 ng/mL, corresponding to a specific activity of > 1.0 × 107IU/mg.
Human IL-4
Figure 5. The ED50 as determined by a cell proliferation assay using human TF-1 cells is less than 0.1 ng/mL,corresponding to a specific activity of >1 × 107 IU/mg.
Human IL-6
Figure 6. The ED50 as determined by a cell proliferation assay using human TF-1 cells is 0.23-0.48 ng/mL, corresponding to a specific activity of > 2.0 × 106IU/mg.
相關文獻:
1.Anna C. Filley1 and Mahua Dey. Dendritic cell based vaccination strategy: an evolving paradigm.J Neurooncol. 2017 Jun; 133(2): 223–235.
2.Emma Verheye,et. al. Dendritic Cell-Based Immunotherapy in Multiple Myeloma: Challenges, Opportunities, and Future Directions.International. Journal of Molecular. Sciences. 2022, 23(2), 904;
