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圖1.PBCV DNA Ligase反應原理示意圖
PBCV DNA Ligase的連接活性遠優于傳統T4 DNA 連接酶，并對以 RNA 為夾板的 DNA 底物表現的出親和力（表觀 Km = 1 nM，Km值越小表示親和力越強），從而能夠對復雜混合物中的 RNA 種類進行亞納摩爾級檢測。因此，該酶非常適合應用于高靈敏度RNA檢測，包括各種SNP的miRNA、mRNA和非編碼RNA的定性或定量檢測，以及用于二代測序和分子診斷。接下來，小編給大家介紹下PBCV DNA Ligase的神奇應用吧！
PBCV DNA Ligase應用解析
原位測序
空間轉錄組學能夠繪制出組織中特定轉錄本的位置，識別特定基因的表達位置，從而可以從分子層面更全面地研究組織，目前主要的空間轉錄組技術包括：
如表所示，原位測序是一種在細胞或組織中直接進行mRNA序列分析的空間轉錄組技術。該技術通過特制探針與目標mRNA雜交，利用滾環擴增（RCA）在特定位置生成信號，接著用熒光染料標記來識別具體序列，已實現保留基因表達的空間信息的目的。今天，小編主要以Mip-seq為例，介紹下PBCV DNA Ligase在原位測序中的應用。Mip-Seq技術通過PBCV DNA Ligase連接構建RCA模板，接著RCA擴增以放大信號，并結合多輪測序以實現高通量檢測，能夠以亞細胞分辨率有效解析DNA、RNA、蛋白質和小分子等多種生物分子，可用于檢測腫瘤基因突變和親本基因的等位基因特異性表達，從而實現精確的腫瘤診斷。
MiP-Seq技術路線如下：
掛鎖探針雜交
使用特定的掛鎖探針（padlock probes）與目標RNA相結合，這些探針帶有RCA啟動子引物探針，用于目標依賴的RCA。
原位滾環擴增（RCA）
使用PBCV DNA Ligase（圖示SplintR連接酶）將掛鎖探針連接成環狀，形成RCA模板，在Phi29聚合酶的作用下進行原位滾環擴增。
數據分析
對原位滾動擴增產物（RCP）進行多輪測序，并通過連接和信號解碼來解讀數據。
圖2. Mip-seq原理圖[1]
高靈敏核酸檢測
分子檢測，特別是核酸檢測，因其快速、靈敏和精準而受到青睞，但無論是標準qPCR技術還是等溫擴增技術都需要一定的實驗設備，限制了病原體檢測的普及性應用。為此，張鋒名下的診斷公司Sherlock Bioscience開發了一款無需儀器、可在環境溫度下實現精確且多重核酸檢測的INSPECTR核酸檢測技術[2]，其應用不僅局限于傳染病診斷，還擴展到檢測抗微生物肽、單核苷酸多態性等方面。
INSPECTR核酸檢測技術原理如下：
連接單鏈DNA
單鏈DNA探針經過設計，在特定靶向RNA上具備同源性，當RNA“扣夾"三元分子結構時，PBCV DNA Ligase（圖示SplintR ligase）進行單鏈DNA的連接。
擴增雙鏈線性產物
DNA聚合酶合成連接后的ssDNA探針的互補鏈，從而產生了編碼報告蛋白的雙鏈DNA（dsDNA）表達盒。
產生報告產物
向表達盒添加含有核糖體、T7 RNA聚合酶、轉錄因子、氨基酸、核苷酸及其他輔因子的無細胞表達（CFE）系統后，產生可通過視覺或電子裝置檢測到的報告蛋白。
圖2. NSPECTR原理圖原理圖[2]
除了上述應用，PBCV DNA Ligase也被應用于EXTRA-CRISPR技術[3]（Cas12介導的高靈敏度miRNA檢測）以及SELECT技術[4]（基于單堿基延伸和連接的qPCR擴增方法）等。在EXTRA-CRISPR技術中，該酶通過連接形成RCA模板，為隨后的RCA擴增和信號增強提供了基礎，顯著提升了Cas12系統對miRNA的檢測敏感性。而SELECT方法則是借助m6A修飾可阻止PBCV DNA Ligase連接兩個寡核苷酸的特性，在經過幾輪m6A選擇后，含m6A的RNA模板產生的連接產物顯著少于未修飾的RNA模板，接著通過qPCR可進行精確定量分析。這些應用實例充分展示了PBCV DNA Ligase在原位測序、RNA檢測等方面的廣闊應用前景。
翌圣PBCV DNA Ligase
翌圣團隊潛心研發，通過翌圣鎂孚泰生物ZymeEditor™酶進化平臺（了解更多），成功推出PBCV DNA Ligase（Cat#14962）。翌圣PBCV DNA Ligase來源于Chorella virus，其蛋白純度＞95%，無核酸外切酶、內切酶、RNase、磷酸酶殘留，特別適用于原位測序、高靈敏核酸檢測等應用場景。
部分數據展示
無核酸外切酶、內切酶、RNase、磷酸酶殘留
將3個批次的翌圣PBCV DNA Ligase (Cat#14962ES)與底物DNA在37℃孵育4 h（125 U 投入量），以及與底物RNA在37℃孵育16 h（25 U 投入量）。瓊脂糖凝膠電泳檢測結果表明，翌圣PBCV DNA Ligase無核酸外切酶、切口酶、RNase殘留。同時，利用磷酸酶檢測盒對3個批次的PBCV DNA Ligase進行檢測，4 h反應后，酶活(µmol/min)數據顯示翌圣PBCV DNA Ligase磷酸酶殘留極低（<0.0001）。
圖3. 核酸外切酶、內切酶、RNase、磷酸酶殘留檢測
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產品應用 | 產品定位 | 產品名稱 | 產品貨號 |
原位測序 | 5'端磷酸化墊鎖探針 | T4 Polynucleotide Kinase | 12902ES、14501ES |
墊鎖探針連接（形成RCA模板） | PBCV DNA Ligase | 14962ES | |
RCA擴增（目標DNA放大） | phi29 DNA Polymerase (10 U/μL) | 14404ES | |
多輪測序連接 | T4 DNA連接酶 | 10298ES | |
成像（以防止RNA在成像過程中發生降解） | Murine RNase Inhibitor | 10610ES、14671ES | |
高靈敏核酸檢測 | / | T7 RNA Polymerase(250 U/μL) | 10626ES |
