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探索體外巨噬細胞極化培養：細胞因子的力量
前言
巨噬細胞（Macrophage）是從血液中的單核細胞分化而來的一種大型吞噬細胞。它們存在于幾乎所有組織中，特別是在那些與外界接觸頻繁的組織如皮膚、肺和腸道，在人體的免疫防御、炎癥反應、組織修復、免疫調節以及疾病發展等多個生物學過程中，巨噬細胞都扮演著至關重要的角色。
原代人類巨噬細胞很難從組織中分離出足夠數量的巨噬細胞，并且在培養中不增殖。單核細胞衍生的巨噬細胞提供了一種的替代品，因為人血液中的單核細胞很容易大量獲得，并且可以在體外分化為巨噬細胞。
巨噬細胞的生物學功能
巨噬細胞通過其表面的受體識別并吞噬病原體和死亡的細胞殘骸。這一過程不僅有助于清除感染，更是防止了這些物質在體內積累，從而可能引發炎癥或其他問題。
巨噬細胞通過產生殺滅微生物的化學物質（如活性氧和氮氧化物）以及調節炎癥反應的細胞因子和化學因子，對抗病原體。
巨噬細胞在炎癥反應中發揮復雜作用。它們不僅可以促進炎癥通過釋放促炎細胞因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細胞介素1（IL-1），還可以通過產生抗炎細胞因子（如IL-10和TGF-β）來抑制炎癥。
在炎癥反應后，巨噬細胞通過分泌各種生長因子幫助組織修復和再生。清除損傷后的殘余同時促進新組織的形成。
巨噬細胞通過呈遞抗原給T細胞，促進特異性免疫應答。同時，它們通過分泌各種細胞因子調節免疫系統的其他成分，如調控T細胞和B細胞的活動。
巨噬細胞在多種疾病的發展中扮演著重要角色，包括感染性疾病、自身免疫疾病、腫瘤以及如動脈粥樣硬化等慢性炎癥性疾病。
巨噬細胞分類
根據其活化狀態和功能的不同，巨噬細胞可以分為M1型和M2型兩大類。這兩種亞型在免疫反應和炎癥調節中發揮著不同的作用。
M1型巨噬細胞
M1型巨噬細胞主要受到如干擾素γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）等細胞因子的刺激，具有促炎性特點。它們具有強烈的抗微生物活性，能夠產生氧自由基和炎癥因子，參與殺傷和清除細菌、病毒等病原微生物。
M1型巨噬細胞參與機體的免疫防御和炎癥反應，促進炎癥和免疫細胞的浸潤，協助清除感染和損傷的組織，促進免疫炎癥反應的發生和維持。
M2型巨噬細胞
M2型巨噬細胞主要受到如白細胞介素-4（IL-4）和白細胞介素-13（IL-13）等細胞因子的刺激，具有抗炎和修復特點。它們參與組織修復和再生過程，促進抗炎反應和免疫調節。
M2型巨噬細胞在炎癥后期和組織修復階段發揮重要作用，促進炎癥的解析和組織修復，調節免疫應答的平衡，促進組織再生和修復。
圖1.活化巨噬細胞的主要巨噬細胞極化狀態總結[1]
巨噬細胞的體外分離、培養及誘導分化
分離方法
從外周血分離
單核細胞的分離：使用密度梯度離心（如Ficoll-Paque）分離外周血單核細胞（PBMCs）。血液樣本加入到Ficoll上層，經離心后，單核細胞會位于血漿和Ficoll層之間。
巨噬細胞的分離：從PBMCs中分離出單核細胞后，可以通過塑料黏附法進一步分離出單核前體細胞。單核細胞在塑料培養皿中培養數小時，非黏附細胞被去除，剩余黏附的細胞主要是單核前體細胞。
從組織中分離
組織樣本經機械和/或酶處理（如膠原酶和DNA酶）分解成單細胞懸液。通過密度梯度離心或負選擇法（使用抗體和磁珠）去除非目標細胞，收集巨噬細胞。
培養方式
常用的培養基包括RPMI 1640或IMDM，通常需要添加10%的胎牛血清（FBS）、1%青霉素/鏈霉素和必要的生長因子。培養條件通常是37°C、5% CO2的恒溫箱中。
誘導分化方法
從單核前體細胞分化
使用M-CSF：在培養基中加入巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF），通常濃度為20-50 ng/mL，連續培養7-10天，促使單核前體細胞分化成巨噬細胞。
使用GM-CSF：使用粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）也可以誘導巨噬細胞的分化，尤其是傾向于產生M1型（促炎型）巨噬細胞。
表型和功能的進一步調控
M1型巨噬細胞：可以通過在培養基中加入IFN-γ（干擾素-γ）和LPS（脂多糖）來誘導。
M2型巨噬細胞：通過添加IL-4和IL-13等抗炎細胞因子誘導。
這些方法使得研究者能夠在體外條件下研究巨噬細胞的多種生物學功能和它們在病理狀態下的行為。每一步的具體操作條件（如細胞密度、培養時間、添加因子的濃度等）可能需要根據實驗的具體目的進行優化。
表1.巨噬細胞培養及誘導條件
細胞來源 | 培養基 | 初始加入 | M1極化 | M2極化 |
THP-1細胞 | RPMI 1640 | 100 ng/ml PMA | 20 ng/ml IFN-γ、 100 ng/ml LPS | 20 ng/ml IL-4、 20 ng/ml IL-13 |
PBMCs(單核細胞來源巨噬細胞MDM) | RPMI 1640 | 50 ng/mL G-CSF 或50 ng/mL M-CSF | 10 ng/ml LPS、 50 ng/ml IFN-γ | 20 ng/ml IL-4、 20 ng/ml IL-10 |
骨髓來源巨噬細胞BMDM | IMDM | 10ng/ml M-CSF | 100 ng/ml LPS （可加50 ng/ml IFN-γ） | 10 ng/ml IL-4 （可加10 ng/ml IL-13） |
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分類 | 種屬 | 貨號 | 規格 |
PMA | PMA(TPA) 佛波肉荳蔻醋酸 | 50601ES | 1 mg |
G-CSF | Human | 91101ES | 2μg/10μg/ 50μg/ 100μg |
Mouse | 91107ES | 2μg/ 10μg/50μg/100μg/500μg | |
M-CSF | Human | 91103ES | 10μg/100μg/500μg |
Mouse | 91109ES | 10μg/100μg/ 500μg | |
GM-CSF | Human | 91102ES | 5μg /50μg/100μg/ 500μg |
Mouse | 91108ES | 5μg /50μg/ 100μg/ 500μg | |
IFN-γ | Human | 91207ES | 20μg /50μg/ 100μg/ 500μg |
Mouse | 91212ES | 5μg /50μg/ 100μg/ 500μg | |
IL-4 | Human | 90105ES | 5μg /50μg/ 100μg/ 500μg |
Mouse | 90144ES | 5μg / 100μg/ 500μg | |
IL-10 | Human | 90109ES | 2μg/ 10μg/ 50μg/ 100μg/ 500μg |
Mouse | 90149ES | 2μg/ 10μg/ 50μg/ 100μg/ 500μg | |
IL-13 | Human | 90112ES | 2μg/ 10μg/ 50μg/ 100μg/ 500μg |
Mouse | 90151ES | 2μg/ 10μg/ 50μg/ 100μg/ 500μg |
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活性驗證：
Human IFN-γ
Figure 2. The ED50 as determined by a cytotoxicity assay using human HT-29 cells is 0.54-0.60 ng/mL, corresponding to a specific activity of> 1.6×106 IU/mg.
Human IL-4
Figure 3. The ED50 as determined by a cell proliferation assay using human TF-1 cells is less than 0.1 ng/mL，corresponding to a specific activity of >1 × 107 IU/mg.
Human IL-10
Figure 4. The ED50 as determined by a cell proliferation assay using murine MC/9 cells is less than 0.1 ng/mL, corresponding to a specificactivity of > 1.0×107 IU/mg.
引用文獻
[1]Atri C, Guerfali FZ, Laouini D. Role of Human Macrophage Polarization in Inflammation during Infectious Diseases. Int J Mol Sci. 2018 Jun 19;19(6):1801.
