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中級(jí)會(huì)員 | 第16年

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標(biāo)記鬼筆環(huán)肽在觀察細(xì)胞骨架時(shí)的運(yùn)用

時(shí)間:2009/4/22閱讀:6462
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鬼筆環(huán)肽(phalloidin 鬼筆鵝膏素)
 

 

  從一種毒性菇類(lèi)中分離的劇毒生物堿,C35H48N8O11S。無(wú)色,細(xì)針狀結(jié)晶,系從毒蕈類(lèi)鬼筆鵝膏(Amanita phalloides)中得到的有毒的環(huán)狀七肽。與鵝膏蕈堿(amanitin)一起存在,毒性比鵝膏蕈堿弱,對(duì)小鼠的致死劑量是50微克,對(duì)人體也有很強(qiáng)的毒性,可引起流涎、嘔吐、便血、發(fā)紺、痙攣、肌肉攣縮,以致死亡。它同細(xì)胞松弛素B的作用相反, 只與聚合的微絲結(jié)合, 而不與肌動(dòng)蛋白單體分子結(jié)合。它同聚合的微絲結(jié)合后, 抑制了微絲的解體, 因而破壞了微絲的聚合和解聚的動(dòng)態(tài)平衡。鬼筆環(huán)肽可以與聚合的微絲結(jié)合的特殊性質(zhì)使得它具有一個(gè)頗富前景的用途:通過(guò)讓這種毒素吸附于熒光染料上面,研究人員可以研究細(xì)胞的內(nèi)部工作機(jī)制,窺視細(xì)胞如何分裂。通過(guò)這些觀察,他們可以揭開(kāi)癌癥工作機(jī)制和組織生長(zhǎng)之謎。
 

 

  美國(guó)加州大學(xué)圣克魯斯分校的兩位化學(xué)家斯科特·洛基和勞拉·舒利斯科(Laura Schuresko)利用一種稱(chēng)為固體階段合成(solid-phase synthesis)的手法,制造出這種致命物質(zhì)。他們不是將幾種化學(xué)物質(zhì)放入燒瓶混合,讓它們自由飄浮,而是在化學(xué)反應(yīng)期間對(duì)其中一種化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行適當(dāng)約束,這樣一來(lái),研究人員在復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中可以更好地對(duì)其進(jìn)行控制。
 

 

  


 

 

  FITC和Rhodamin等熒光物質(zhì)標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽可特異的與真核細(xì)胞的F-acting結(jié)合,從而顯示微絲骨架在細(xì)胞中的分布。鬼筆環(huán)肽的配制:0.1mg鬼筆環(huán)肽溶于1ml無(wú)水甲醇(也可用DMSO或無(wú)水乙醇溶解)配成貯存液,可在-20度避光的條件下長(zhǎng)期保存,工作液的濃度為5ug/ml,由貯存液加生理鹽水PBS稀釋20倍即可。
 

 

  染色程序:
 

 

  生理鹽水PBS清洗細(xì)胞2次,每次10分鐘;
 

 

  3.7%-4%的甲醛或多聚甲醛固定20分鐘,生理鹽水PBS清洗細(xì)胞2次;
 

 

  加入5ug/ml的FITC-鬼筆環(huán)肽室溫染色30-60分鐘,夏季時(shí)間可以短一些,生理鹽水PBS清洗細(xì)胞2次;
 

 

  DAPI或hoechst33258染細(xì)胞核10分鐘,生理鹽水PBS清洗細(xì)胞2次;
 

 

  吸去多余水分,加熒光封片液(中性或偏堿性緩沖液加等量甘油),蓋上蓋玻片,熒光或共聚焦顯微鏡下觀察。
 

 

  注意事項(xiàng):
 

 

  鬼筆環(huán)肽的分子量小,很容易通過(guò)細(xì)胞,不需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行冷丙酮和TRITON X-100處理。
 

 

  藥品價(jià)格昂貴,0.1mg的售價(jià)接近兩千元,要節(jié)約使用。
 

 

  毒性較大,戴上手套操作。
 

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