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用淋巴細胞分離液分離單個核細胞

時間:2009/4/7閱讀:3597
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1)分離外周血中的單個核細胞(PBMC)
1.抽取正常人靜脈血加到肝素抗凝管中,加等量含5~10IU/ml肝素的無血清緩沖液懸浮細胞。將細胞懸液小心加在與血液等量的淋巴細胞分離液上,室溫中,水平離心500×g 20分鐘。此時離心管中形成5層:zui上面是血漿,血漿層和淋巴細胞分離液之間是PBMC,淋巴細胞分離液層和zui下面的紅細胞層之間是粒細胞層,又成為棕黃層。
2.吸去zui上層的血漿,收集血漿層和淋巴細胞分離液交界面的單個核細胞,盡量全部吸出PBMC。加1~2倍量含5IU/ml肝素、2%滅活小牛血清的Hanks液(洗滌液),混勻后離心200×g 10分鐘,低速離心有利于去除細胞懸液中留存的血小板,去上清液。
3.再用同樣洗滌液洗滌細胞2次,每次離心500×g 10分鐘,洗去殘留的淋巴細胞分離液。用1%臺盼藍染色檢測細胞活力(應>95%)并計數細胞。再用含10%小牛血清的細胞培養液將細胞配成適當濃度。通常,每毫升外周血可得1×106~2×106PBMC。
 
2)分離關節滑液中的單個核細胞
1.將關節滑液置含肝素(終濃度5IU/ml)的離心管中,離心1000×g 15分鐘。
2.用含2%滅活小牛血清的Hanks液懸浮沉淀細胞并洗滌細胞1次,每次離心1000×g 15分鐘。用含2%滅活小牛血清的Hanks液懸浮細胞至原容量。
3.用淋巴細胞分離液分離關節滑液中的單個核細胞,并用含10%小牛血清的細胞培養液將細胞配成適當濃度。
 
3)分離組織中的單個核細胞
1.取外科分離的各種組織,用含1%慶大霉素和1%小牛血清的MEM培養液洗滌組織塊,洗去可能的污染物。將組織塊置培養皿中,加入約為組織塊體積5~10倍的同樣MEM培養液。用無菌外科剪刀將組織塊剪碎成0.5mm3大小。
2.將組織塊轉移到小培養瓶中,靜置片刻,吸去培養液。加入約2倍組織塊體積的、濾過除菌的酶溶液。37℃水浴搖床中消化1~2小時,注意組織塊的消化程度。
3.當組織塊消化分散后,用手用力搖晃培養瓶3~5分鐘或用大口吸管反復吹打,使細胞團進一步分散。加入30ml上述MEM培養液,終止酶反應。
4.讓上述懸液通過200目的金屬網或尼龍網,分離單個細胞。用上述MEM培養液洗滌細胞3次,每次離心1000×g 10分鐘。用1%臺盼藍染色法檢測細胞活力并計數細胞。
5.如果細胞量較多(>107),應當用上述淋巴細胞分離液分離出單個核細胞,并用含10%小牛血清的細胞培養液將細胞配成適當濃度。
 
4)從小鼠胸腺中分離胸腺細胞
1.脫臼或剪頭處死小鼠,置75%乙醇中浸泡消毒。腹面向上固定,剪開小鼠胸腔,暴露和摘取胸腺。在平皿中用Hanks液洗凈血液,去除結締組織。
2.在有少量細胞培養液的平皿中,用鑷子梳理胸腺,再用大口吸管反復吹打,分離單個細胞。離心沉淀細胞,用細胞培養液洗滌細胞1次。加入適量細胞培養液,靜置5分鐘,讓大的組織塊自然沉降,吸出單個胸腺細胞。
3.用1%臺盼藍染色法檢測細胞活力,計數細胞。再用含10%小牛血清的細胞培養液將細胞配成適當濃度。

如果客戶希望步驟更簡單的話,我向您推薦我們的單個核細胞分離液。

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