血清免疫球蛋白的分離制備操作:
(1)在1支離心管中加入5ml血清和5ml 0.01mol/L,PH7.0 磷酸鹽緩沖液,混勻。用皮頭滴管吸取飽和硫酸銨溶液,邊滴加邊攪拌于血漿溶液中,使溶液的zui終飽和度為20%(應加入飽和硫酸銨溶液多少毫升?),用滴管邊加邊攪拌,是為防止飽和硫酸銨1次性加入或攪拌不均勻造成局部過飽和的現象,使鹽析達不到預期的飽和度,得不到目的蛋白質。攪拌時不要過急以免產生過多泡沫,致使蛋白質變性。加完后應在4℃放置15min,使之充分鹽析。然后以3000r/min離心10min。棄去沉淀(沉淀為纖維蛋白原),在上清液中為清蛋白、球蛋白。
(2)量取上清液的體積,置于另一離心管中,用滴管繼續在上清液中滴加飽和硫酸銨溶液,使溶液的飽和度達到50%(應加飽和硫酸銨溶液多少毫升?)。加完后在4℃放15min,以3000r/min離心10min,清蛋白在上清液中,沉淀為球蛋白。棄去上清液,留下沉淀部分。
(3)將所得的沉淀再溶于5ml0.01mol/L,PH7.0磷酸鹽緩沖液中。滴加飽和硫酸銨溶液,使溶液的飽和度達35%(應加入飽和硫酸銨溶液多少毫升?)。加完后4℃放置20min,以3000r/min離心15min,a,b球蛋白在上清液中,沉淀為IgG。棄去上清液,即獲得粗制的IgG沉淀。
為了進一步化,操作(3)可得1~2次。將獲得的粗IgG沉淀溶解于2ml0.0175mol/L,PH6.7磷酸鹽緩沖液中備用。
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