一、試劑盒組成

1. 預(yù)包被微孔板：96孔，包被有針對(duì)DAAO的捕獲抗體。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品：已知濃度的DAAO標(biāo)準(zhǔn)品（如0-1000 pg/mL）。

3. 檢測(cè)抗體：生物素標(biāo)記的DAAO抗體。

4. 酶標(biāo)試劑：HRP標(biāo)記的鏈霉親和素。

5. 底物A/B液：TMB顯色底物。

6. 終止液：硫酸溶液（1M）。

7. 洗滌緩沖液：濃縮型（需稀釋使用）。

8. 封板膜：防止蒸發(fā)。

9. 說(shuō)明書(shū)：包含詳細(xì)操作步驟及參數(shù)。

二、實(shí)驗(yàn)原理

基于雙抗體夾心法，通過(guò)生物素-鏈霉親和素放大系統(tǒng)檢測(cè)小鼠DAAO：

1. 樣本中的DAAO與包被抗體結(jié)合。

2. 加入生物素化檢測(cè)抗體，形成“抗體-DAAO-檢測(cè)抗體"復(fù)合物。

3. 鏈霉親和素-HRP與生物素結(jié)合，催化底物顯色。

4. 終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀讀取450nm吸光度（OD值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本濃度。

三、操作步驟

1. 樣本準(zhǔn)備

• 血清/血漿：離心分離（3000×g, 10分鐘），取上清，避免溶血。

• 組織勻漿：勻漿后離心（12000×g, 20分鐘），取上清，按說(shuō)明書(shū)稀釋。

• 細(xì)胞培養(yǎng)上清：離心去除細(xì)胞碎片，直接檢測(cè)或稀釋。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品配制

• 將凍干標(biāo)準(zhǔn)品用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液復(fù)溶，梯度稀釋?zhuān)ㄈ?000、500、250、125、62.5、31.25 pg/mL）。

3. 加樣與孵育

1. 加樣本/標(biāo)準(zhǔn)品：每孔100μL，設(shè)空白孔（不加樣本，只加稀釋液）。

2. 封板：覆膜，37℃溫育90分鐘。

3. 洗板：棄液，每孔加350μL洗滌液，靜置30秒，甩干（重復(fù)3次）。

4. 加檢測(cè)抗體

1. 每孔加100μL生物素化檢測(cè)抗體（稀釋后），37℃孵育60分鐘。

2. 洗板（同上）。

5. 加酶標(biāo)試劑

1. 每孔加100μL HRP-鏈霉親和素，37℃孵育30分鐘。

2. 洗板（5次）。

6. 顯色與終止

1. 每孔加50μL底物A和B液，37℃避光孵育15分鐘。

2. 加50μL終止液，10分鐘內(nèi)讀取OD值（450nm，參考波長(zhǎng)630nm）。

7. 結(jié)果計(jì)算

• 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（Log濃度 vs. Log OD），用軟件（如Curve Expert）擬合四參數(shù)方程。

• 樣本濃度通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線反推。

四、注意事項(xiàng)

1. 試劑保存：未用試劑4℃保存，避免冷凍；標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶后-20℃凍存（1周內(nèi)用完）。

2. 溫控：嚴(yán)格按37℃孵育時(shí)間操作，避免誤差。

3. 避免交叉污染：加樣時(shí)換槍頭，洗板。

4. 顯色控制：顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能導(dǎo)致OD值過(guò)高，需統(tǒng)一時(shí)間終止反應(yīng)。

5. 空白孔校正：以空白孔調(diào)零。

五、常見(jiàn)問(wèn)題與解決

六、檢測(cè)范圍與靈敏度

• 檢測(cè)范圍：通常為31.25–1000 pg/mL（具體以說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)）。

• 靈敏度：檢測(cè)限約15–30 pg/mL。

七、儲(chǔ)存條件

• 未開(kāi)封試劑盒：2–8℃保存，有效期6個(gè)月。

• 開(kāi)封后：微孔板密封保存，其他試劑4℃存放，3個(gè)月內(nèi)用完。