高效感受態(tài)細胞制備試劑盒

目錄號：30018

試劑盒組成、儲存、穩(wěn)定性：

短期使用4℃，避免污染。長期保存－20℃一年有效。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準

產(chǎn)品介紹：

1.   高效感受態(tài)細胞制備試劑盒是在傳統(tǒng)高效感受態(tài)細胞制備方法的基礎上進行適當改良而成，操作便捷，轉化效率高。

2.   使用本試劑盒可以使感受態(tài)效率達到10⁸ cfu/μg質(zhì)粒。對于小的質(zhì)粒效率略高，而對于大的質(zhì)粒則效率略低一些。用本試劑盒制備的高效感受態(tài)細胞不僅可以轉化質(zhì)粒，而且非常適合于轉化普通的連接產(chǎn)物，特別適合于轉化平端連接等需要高轉化效率的情況。

3.   使用本試劑盒操作簡單，細菌培養(yǎng)好后僅需60分鐘左右即可完成高效感受態(tài)細胞的制備。

4.   本試劑盒適用于絕大部分常見的大腸桿菌，包括Top 10、DH5α、BL21（DE3）、JM109、TG1、HB101和XL-1等。但是不同的菌種，轉化效率可能有很大差別。

5.   本試劑盒可以分多次使用，共可以制備100支100μl的感受態(tài)細胞。

v  注意事項：

1.          所有試劑、耗材、儀器、設備務必經(jīng)過滅菌處理。

2.          在制備感受態(tài)細胞的過程中均使用不含抗生素的LB。在使用感受態(tài)菌的過程中熱休克后的37℃培養(yǎng)時也必須使用無抗生素的LB，即便轉入的質(zhì)粒是有抗性的。

3.          感受態(tài)細胞制備完畢請快速轉入-70℃。

操作步驟：(實驗前請先閱讀注意事項)

1.   涂平板： 

為取得最佳的感受態(tài)效率，必須先把甘油菌或其它形式保存的菌種涂LB平板，并培養(yǎng)過夜。 

2.   接種：

取一有新鮮培養(yǎng)的菌種的LB平板，后續(xù)操作均在超凈臺內(nèi)進行。把鑷子的頂端在70%酒精中蘸一下，并在酒精燈上略略燒一下，使鑷子的頂端處于無菌狀態(tài)。用鑷子夾取一個無菌的塑料槍頭或牙簽，從平板上挑取一個單克隆，然后把蘸有菌種的塑料槍頭或牙簽放到裝有3毫升SOB或者LB（客戶應該根據(jù)菌種不同選擇適合的培養(yǎng)基）的細菌培養(yǎng)試管內(nèi)。上述操作也可以使用接種環(huán)等進行操作。 

3.   培養(yǎng)：

37℃約250rpm培養(yǎng)過夜，通常培養(yǎng)時間控制在16小時左右為宜。絕對不宜超過18小時。 

4.   再接種培養(yǎng)：

根據(jù)需要制備的高效感受態(tài)細胞的量，按照1:500的比例用新鮮培養(yǎng)的過夜菌接種培養(yǎng)。例如取100微升的新鮮過夜菌到50毫升SOB或者LB中，37℃約250rpm培養(yǎng)。

5.   制備感受態(tài)細胞： 

e  注意：離心機轉速和離心時間對于感受態(tài)細胞制作非常重要，不同種類的細菌最佳的轉速和離心時間不同，應該根據(jù)具體情況優(yōu)化。最佳狀況是適當?shù)霓D速和離心時間讓細菌剛好離心沉淀下來，又不能太緊密，否則重懸困難，只能用力吹打才能重懸，會對細胞造成損害，影響轉化效率。

1)  在培養(yǎng)的細菌OD600達到0.5左右時，把培養(yǎng)的菌液置于冰浴中，冷卻15分鐘。注意：后續(xù)所有操作均須在4度或冰浴進行。

2)   4℃（離心機必須預先冷卻）3000-3500g離心5分鐘收集細菌，棄上清（盡量去除干凈上清，殘留越少越好）。

3)  如果離心沉淀前的菌量為50毫升，按后續(xù)操作進行，如果是其它體積則按比例換算后進行后續(xù)操作。 

4)   用10毫升預冷的高效感受態(tài)制備溶液A輕輕重懸細菌沉淀（為方便重懸，可先加少量溶液A，重懸后再加入剩余的溶液A），吹打重懸時一定要很輕柔，否則會影響效果。

5)  冰浴15分鐘。 

6)   4℃（離心機必須預先冷卻） 3000-3500g離心5－7分鐘收集細菌，棄上清。

7)   用2毫升預冷的高效感受態(tài)制備溶液B輕輕重懸細菌沉淀。吹打重懸時時一定要很輕柔，否則會影響效果。 

8)   冰浴15分鐘。 

9) 冰浴上進行分裝，可以根據(jù)需要適當分裝成50-200微升/管。 

10) 立即使用或用液氮或乙醇干冰浴速凍后-70℃保存。