纖維素（CLL）含量試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

纖維素CLL含量試劑盒 糖代謝

正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

纖維素是由葡萄糖組成的大分子多糖，通常與半纖維素、果膠和木質(zhì)素結(jié)合在一起，是植物細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)成分。纖維素是一種重要的膳食纖維，是自然界中分布zui 廣、含量最多的一種多糖。

測定原理：

纖維素為β－葡萄糖殘基組成的多糖，在酸性條件下加熱能分解成β－葡萄糖。β－葡萄糖在強(qiáng)酸作用下，可脫水生成β－糠醛類化合物。β－糠醛類化合物與蒽酮脫水縮合，生成糠醛衍生物。顏色的深淺可間接定量測定纖維素含量。

組成：

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、80％乙醇、丙酮、濃硫酸（不允許快遞）、研缽和蒸餾水。

樣品的前處理：

1、細(xì)胞壁的提取：取約 0.3g 樣本，加入 1ml 80％乙醇，室溫快速勻漿，90℃水浴 20min（加熱過程中EP管可能爆開，建議用膠帶封口或使用防爆 EP 管），冷卻至室溫，6000g 25℃離心 10min，棄上清。沉淀加入 1.5ml80％乙醇和丙酮各洗一遍（渦旋振蕩 2min 左右，6000g 25℃離心 10min，棄上清即可），沉淀即為粗細(xì)胞壁，加入 1ml 試劑一（去除淀粉）浸泡 15 小時(shí)，6000g 25℃離心 10min，棄上清，將沉淀干燥，稱重得細(xì)胞壁物質(zhì)（CWM）。

2、纖維素的提取：稱取烘干的CWM 約 5mg，加入 0.5ml 蒸餾水充分勻漿(若烘干物質(zhì)質(zhì)地堅(jiān)硬，可先研碎后再加入 0.5ml 蒸餾水勻漿，或者用勻漿器勻漿)，勻漿液轉(zhuǎn)移至EP 管中，用蒸餾水定容至 0.5ml，置于冰水浴中，緩慢加入 0.75ml 濃硫酸，混勻，冰水浴中靜置 30min。8000g 4℃離心 10min，取上清液，用蒸餾水稀釋 20 倍后待測。

測定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 620nm，蒸餾水調(diào)零。

2、調(diào)節(jié)水浴鍋至 95 度。

3、工作液的配制：在試劑二中加入 4ml 試劑三，充分溶解，如較難溶解，可加熱攪拌；用不完的試劑 4℃

保存一周；

4、加樣表（在EP 管中反應(yīng)）：

混勻，置 95 度水浴中 10min（蓋緊，以防止水分散失），冷卻至室溫后，取 200μl 至微量石英比色皿或96 孔板中，于 620nm 處，分別讀取空白管和測定管吸光值，ΔA=A 測定管-A 空白管。

注意：

1、空白管只要做一管。

2、由于濃硫酸具有強(qiáng)腐蝕性，請謹(jǐn)慎操作。

纖維素含量計(jì)算：

用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為 y = 7.875x - 0.0043；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/ml），y 為吸光值。

2、按樣本質(zhì)量計(jì)算：

纖維素（mg /g 干重）= [(ΔA＋0.0043) ÷7.875×V1]÷（W×V1÷V2）×20=3.17×(ΔA＋0.0043) ÷W。

V1：加入樣本體積，0.15ml；V2：加入提取液體積，1.25ml；W：樣本干重，5×10-3g；20：樣本稀釋倍數(shù)。

用 96 孔板測定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為 y = 5.25x - 0.0043；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/ml），y 為吸光值。

2、按樣本質(zhì)量計(jì)算：

纖維素（mg /g 干重）= [(ΔA＋0.0043) ÷5.25×V1]÷（W×V1÷V2）×20=4.76×(ΔA＋0.0043)÷W。

V1：加入樣本體積，0.15ml；V2：加入提取液體積，1.25ml；W：樣本干重，約 5×10-3g；20：樣本稀釋倍數(shù)。

注意：最di檢測限為 1mg/g 干重或 10ng/ mg prot

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