2022年12月22日，來自加州大學(xué)圣地亞哥分校的Gene W. Yeo和Karen B. Chapman研究組合作在Nature Methods上以Brief Communication形式發(fā)表了題為Multiplexed transcriptome discovery of RNA-binding protein binding sites by antibody-barcode eCLIP的文章，提出了一種新的抗體條形碼eCLIP（antibody-barcode eCLIP, ABC）方法，極大提高了CLIP技術(shù)的便捷性和效率。
當(dāng)前CLIP技術(shù)無法大規(guī)模應(yīng)用主要存在兩個限制因素。第一，所有基于CLIP的方法都要先通過SDS-PAGE分離蛋白然后轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上，依據(jù)分子量大小選擇免疫沉淀的蛋白-RNA復(fù)合物。這種人工切取蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物條帶的方法很繁瑣，需要額外的1.5-2天，并且容易受到操作者之間差異的影響。第二，每個單獨的RBP需要特定的免疫沉淀（IP）步驟，這對研究多個RBP所需的原始材料數(shù)量造成了負擔(dān)。針對以上兩個問題，研究團隊人員通過加入DNA條形碼抗體，優(yōu)化了eCLIP的兩個限制，允許基于珠上近距離的連接（on-bead proximity-based ligations）取代SDS-PAGE和膜轉(zhuǎn)移步驟。此外，DNA條形碼還可以區(qū)分同一樣品中不同RBP，極大地降低了每個RBP的起始樣品量。研究人員將這種方法命名為抗體條形碼eCLIP（antibody-barcode eCLIP, ABC），具體流程如下圖。
具體地，研究人員使用兩種特征明確的RBP評估抗體條形碼eCLIP新方法，分別是RNA結(jié)合Fox-1同源物2 （RBFOX2），它識別GCAUG基序，以及莖環(huán)結(jié)合蛋白（SLBP），它與組蛋白mRNA特異性相互作用。研究結(jié)果表明抗體條形碼eCLIP和常規(guī)eCLIP得到的結(jié)果基本一致，如下圖。這也驗證了體條形碼eCLIP方法的可行性和準(zhǔn)確性。
抗體條形碼eCLIP的一個決定性優(yōu)勢是可以從單個樣本中同時檢測多個RBP，因此研究人員在K562細胞中選擇了9個先前在ENCODE3中報道過的RBP，來展示基因區(qū)域內(nèi)已知結(jié)合位點的多樣性，其中包含5' UTR中的DDX3和EIF3G；3' UTR中的IGF2BP2、FAM120A、PUM2和ZC3H11A；CDS中的LIN28B；3'剪接位點的SF3B4和5'剪接位點下游的PRPF8。經(jīng)過比對分析表明抗體條形碼eCLIP和單獨eCLIP方法的檢測結(jié)果相似，見下圖。
綜上所述，研究人員提出了一種稱為抗體條形碼eCLIP的新方法，在使用單一eCLIP實驗相同材料的基礎(chǔ)上，不僅簡化了操作流程，同時也極大增加一次性檢測RBP的通量，這將有助于樣品來源稀少，且往往投入有限的臨床標(biāo)本檢測。
參考文獻
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