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抗體條形碼eCLIP:快速、微量、高通量的蛋白質-RNA檢測技術

閱讀:1381      發布時間:2024-5-16
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 RNA和蛋白質相互作用研究主要通過紫外交聯和免疫沉淀(CLIP)技術,但即便是目前最新的增強型CLIPeCLIP)技術,在改進了RNA片段文庫制備方法的基礎上,也需要4天的時間才能完成一次實驗,且缺乏并行處理多個RNA結合蛋白(RBP)的能力。

20221222日,來自加州大學圣地亞哥分校的Gene W. YeoKaren B. Chapman研究組合作在Nature MethodsBrief Communication形式發表題為Multiplexed transcriptome discovery of RNA-binding protein binding sites by antibody-barcode eCLIP的文章,提出了一種新的抗體條形碼eCLIPantibody-barcode eCLIP, ABC)方法,極大提高了CLIP技術的便捷性和效率。

CLIP技術無法大規模應用主要存在兩個限制因素。第一,所有基于CLIP的方法都通過SDS-PAGE分離蛋白然后轉移到硝化纖維膜,依據分子量大小選擇免疫沉淀蛋白-RNA復合物。這種人工切蛋白質-RNA復合物條帶的方法很繁瑣,需要額外的1.5-2天,并且容易受到操作者之間差異的影響。第二,每個單獨的RBP需要特定的免疫沉淀IP步驟,這對研究多個RBP所需的原始材料數量造成了負擔。針對以上兩個問題,研究團隊人員通過加入DNA條形碼抗體,優化了eCLIP的兩個限制,允許基于珠上近距離的連接on-bead proximity-based ligations取代SDS-PAGE和膜轉移步驟。此外DNA條形碼還可以區分同一樣品中不同RBP,極大地降低了每個RBP起始樣品量研究人員將這種方法命名為抗體條形碼eCLIPantibody-barcode eCLIP, ABC具體流程如下圖

 

 

具體地,研究人員使用兩種特征明確的RBP評估抗體條形碼eCLIP新方法,分別是RNA結合Fox-1同源物2 RBFOX2,它識別GCAUG基序,以及莖環結合蛋白SLBP,它與組蛋白mRNA特異性相互作用。研究結果表明抗體條形碼eCLIP常規eCLIP得到的結果基本一致,如下圖。這也驗證了體條形碼eCLIP方法的可行性和準確性。

 

 

抗體條形碼eCLIP的一個決定性優勢是可以從單個樣本中同時檢測多個RBP因此研究人員K562細胞中選擇了9個先前ENCODE3中報道過的RBP來展示基因區域內已知結合位點的多樣性其中包含5' UTR中的DDX3EIF3G3' UTR中的IGF2BP2FAM120APUM2ZC3H11ACDS中的LIN28B3'剪接位點SF3B45'剪接位點下游PRPF8經過比對分析表明抗體條形碼eCLIP和單獨eCLIP方法檢測結果相似,見下圖。

 

 

綜上所述,研究人員提出了一種稱為抗體條形碼eCLIP的新方法,在使用單一eCLIP實驗相同材料的基礎上不僅簡化了操作流程同時也極大增加一次性檢測RBP通量,這將有助于樣品來源稀少,且往往投入有限的臨床標本檢測。

 

參考文獻

1. Ule, J., Jensen, K., Mele, A. & Darnell, R. B. CLIP: a method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells. Methods 37, 376–386 (2005).

2. Wheeler, E. C., Van Nostrand, E. L. & Yeo, G. W. Advances and challenges in the detection of transcriptome-wide protein-RNA interactions. Wiley Interdiscip. Rev. RNA 9, e1436 (2018).

3. Hafner, M. et al. CLIP and complementary methods. Nat. Rev. Methods Primers 1, 20 (2021).

4. Daniel L. et al. Multiplexed transcriptome discovery of RNA-binding protein binding sites by antibody-barcode eCLIP. Nature Methods 20, 65–69 (2023).

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