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Cell Reports Methods:報告基因檢測細胞間蛋白交換

閱讀:849      發布時間:2024-5-16
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 細胞通訊(intercellular communication)是多細胞生物維持穩態的重要組成部分,在腫瘤發生、衰老、感染性疾病中發揮著關鍵作用。細胞通訊通常分為依賴接觸的直接通訊和以可溶性因子和細胞外囊泡(extracellular vesicle, EV)的交換為基礎的間接通訊。目前,研究細胞通訊有一個關鍵的難點在于如何區分逃出核內體(endosome)并在細胞質內發揮功能的蛋白質和被溶酶體降解或釋放回細胞外空間的蛋白質。目前缺少有效地監測和量化細胞通訊間的功能性蛋白質交換的方法。2023227日,來自美國麻省總醫院和哈佛醫學院Killian P. O’Brien課題組Cell Reports MethodsReport形式發表題為Illuminating cellular and extracellular vesicle-mediated communication via a split-Nanoluc reporter in vitro and in vivo的文章,設計了一種基于報告基因信號功能蛋白傳遞的工具,可用于研究細胞間和細胞外囊泡介導的體外和體內通信。

研究人員首先構建兩個分裂蛋白N6566C,這兩個大小相當的蛋白(N6510.3 kDa, 66C13.5 kDa在彼此靠近時自發地發生結構變化,當與底物furimazineFMZ孵育時,可以催化產生明亮穩定的發光信號。例如,只有當HEK細胞中同時轉染兩種結構的分裂蛋白后,在細胞和培養基中才能檢測出發光信號。然后研究人員利用這個工具來探究不同的細胞培養方式蛋白質的交換,包括直接共培養間接培養。在直接培養模式中,無論是利用Hela細胞直接共培養體系還是人源性膠質瘤細胞系U87和永生化人源星形膠質細胞的直接共培養體系均可以在細胞內和培養基中檢測到N6566C兩者蛋白轉移此外在人源性膠質瘤細胞系U87和永生化人源星形膠質細胞的間接共培養體系,也可以在細胞內和培養基中檢測到明顯的發光信號。這些結果表明通過分裂報告基因可以監測細胞通訊間的蛋白質轉移。

 

 

分裂報告基因構建功能蛋白轉移檢測

 

細胞通訊蛋白質轉移很可能是通過胞外囊泡運輸實現為了驗證這一猜想研究人員收集了高濃度的胞外囊泡然后直接將胞外囊泡添加到轉染N6566CHeLa細胞中結果也發現Hela細胞和培養基中均可以檢測到發光信號。此外為了進一步證明該工具的多功能性,研究人員將核定位信號(nuclear localization signal, NLS融合到N65結構中,發現兩種NLS結構的直接共培養沒有導致發光信號的顯著增加,NLS-N65與正常66C HEK細胞直接共培養時,發光信號明顯增加。最后,研究人員還在動物體內驗證了該工具的實用性。先將乳腺癌細胞MDA-MB-231帶有N6566C結構,然后無胸腺裸鼠皮下注射MDAMB-231-N65MDA-MB-231-66C細胞或兩者混合,結果發現與只有一種細胞的對照組相比,在由兩種細胞組成的腫瘤中可以檢測到強烈的發光信號,且這種信號隨著時間的推移而增加。這也表明該工具可以用于研究體內的細胞通信。

 

 

胞外囊泡介導的蛋白傳遞體內蛋白傳遞

 

綜上所述,研究人員開發一種檢測蛋白質直接、間接或胞外囊泡介導的通信功能傳遞的方法展示了該方法在體內和體外的功能性和適應性。這一工具將有助于研究人員評估和改善細胞通信和功能性胞外囊泡介導的傳遞,并進一步幫助我們理解體外和體內的細胞通信。

參考文獻

1. Thomas S. S. et al. Illuminating cellular and extracellular vesicle-mediated communication via a split-Nanoluc reporter in vitro and in vivo. Cell Reports Methods 3, 2667-2375 (2023).

2. J. Zhao et al. Self-assembling NanoLuc luciferase fragments as probes for protein aggregation in living cells. ACS Chem. Biol. 11, 132-138 (2016).

3. B.A. Yang et al. Engineered tools to study intercellular communication. Adv. Sci. 8, 2002825 (2021).

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