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原代神經(jīng)元的磁輔助轉(zhuǎn)染
實驗原理
磁轉(zhuǎn)染TM 是一種新穎、簡單而高效的細胞體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)染方法。這項技術(shù)利用磁力來驅(qū)動結(jié)合了磁性粒子的核酸進入靶細胞，從而使細胞能在幾分鐘之內(nèi)獲得*劑量的RNA或DNA，且各細胞獲得量基本一致。NeuroMag是一個專為初級神經(jīng)細胞和神經(jīng)細胞系的高效率轉(zhuǎn)染而設(shè)計的磁性納米粒子配方，是神經(jīng)科學(xué)研究中一種理想的轉(zhuǎn)染試劑。
如今可以非常高效地將各類核酸如DNA、RNA或寡核苷酸轉(zhuǎn)染進初級神經(jīng)元和永生化神經(jīng)細胞中，特別是原代海馬細胞或皮質(zhì)激素神經(jīng)元細胞。NeuroMag兼容于血清，可以用于瞬時和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，是一種非常穩(wěn)定，可應(yīng)用的和僅用于研究目的技術(shù)。
實驗試劑
1. 分離液：含0.25％D-葡萄糖的HBSS（無鈣，鎂），保持在4°C，現(xiàn)配現(xiàn)用。
2. 培養(yǎng)基：MEM中加入10％的Nu-血清，15mM的pH值7.2的HEPES，0.45％葡萄糖，1mM丙酮酸鈉，2mM的L-谷氨酰胺，10 IU/ml的青-鏈霉素。
3. 營養(yǎng)培養(yǎng)基：MEM中加入2%的B27，15mM的HEPES，葡萄糖0.45％，1mM的丙酮酸鈉，2mM谷氨酰胺。
實驗設(shè)備
組織培養(yǎng)容器準備：
1. 將水溶性多聚L-賴氨酸（Sigma公司，P-1520）0.1 mg/mL溶于水中（分裝和存儲在-20°C）。
2. 將蓋玻片或培養(yǎng)皿用多聚L-賴氨酸覆蓋。
3. 37°C孵育過夜。
4. 水沖洗兩次。
5. 在無菌層流罩中干燥
實驗材料
海馬神經(jīng)元細胞或神經(jīng)細胞系
實驗步驟
1. 細胞
1) 原代神經(jīng)元細胞：一般來說培養(yǎng)了7至21天的細胞都可以進行實驗，但體外培養(yǎng)天數(shù)(DIV)為10-15天(依據(jù)不同的培養(yǎng)條件)的細胞用來實驗。轉(zhuǎn)染前24小時更換50％的培養(yǎng)基。
2) 細胞系：于轉(zhuǎn)染實驗的前一天準備。
2. DNA / NeuroMag復(fù)合物的制備
1) NeuroMag：渦旋并適量加入至微管中。
2) DNA：稀釋數(shù)量的DNA至50~700微升的無血清和補充的培養(yǎng)基中
3) 將上述DNA溶液加入到NeuroMag溶液中，渦旋或吹打后在室溫下孵育15至20分鐘。
3. 轉(zhuǎn)染
1) 將NeuroMag / DNA復(fù)合物逐滴添加到培養(yǎng)的細胞(細胞> 10 DIV時，生長于營養(yǎng)培養(yǎng)基中，如果<10DIV，則培養(yǎng)于培養(yǎng)基中)，輕拍培養(yǎng)板以確保均勻分布，于15分鐘內(nèi)置于磁板之上。
2) 移除磁板。
3) 細胞在37°C 標(biāo)準條件下于CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到用于評價轉(zhuǎn)基因表達(24小時至7天)。
4) 方法的優(yōu)化
雖然上述快速方法轉(zhuǎn)染效率較高，但在特定的細胞系或原代細胞培養(yǎng)中，可能需要優(yōu)化如下幾個參數(shù)以獲得最高的轉(zhuǎn)染效率：核酸的劑量、NeuroMag與核酸的比例、細胞密度和孵化時間。建議您一次優(yōu)化一個參數(shù)。
a. 優(yōu)化DNA的量
為達到最佳的轉(zhuǎn)染效率，DNA的量可以增加或減少。重要的是要始終保持不斷優(yōu)化過程中的細胞數(shù)和培養(yǎng)時間。調(diào)整DNA最佳量時需要維持一個NeuroMag與DNA的固定比例(每微克DNA用3.5μg的NeuroMag)，在建議的范圍進行調(diào)整。
b. NeuroMag / DNA比值的優(yōu)化
首先保持一個固定數(shù)量的DNA(根據(jù)您的培養(yǎng)皿中，細胞數(shù)量和以前的優(yōu)化結(jié)果)，然后在2至5μL的范圍內(nèi)調(diào)整每微克DNA中NeuroMag的量。
c. 細胞數(shù)量
細胞數(shù)量(密度)也是一個重要的參數(shù)，為達到良好的轉(zhuǎn)染效率，根據(jù)所使用的細胞進行調(diào)整的最佳調(diào)整。合適的細胞密度取決于增長率和細胞的培養(yǎng)條件，同等條件下，較好的細胞融合度比低細胞密度好。
d. 時間：
尋找轉(zhuǎn)染與細胞基因活性檢測，如啟動子活性，表達產(chǎn)物等之間的孵育時間，可通過檢測轉(zhuǎn)染24小時后到7天之間的基因產(chǎn)物來監(jiān)測轉(zhuǎn)染效率。報告基因如綠色熒光蛋白，β-半乳糖苷酶，堿性磷酸酶或熒光素酶可以用來定量測量基因表達。
5) 共轉(zhuǎn)染
在對多個質(zhì)粒DNA進行共轉(zhuǎn)染時，將每個質(zhì)粒取相同數(shù)量進行混合，再依如上所述條件進行轉(zhuǎn)染。例如，如果你有兩個DNA質(zhì)粒，則每質(zhì)粒取1微克，再與7μL的NeuroMag混合，進行實驗。
6) 共轉(zhuǎn)染的選擇
共轉(zhuǎn)染只能實現(xiàn)順序轉(zhuǎn)染，而不能同時進行。因此，一個細胞在轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA4小時至24小時以后可以與其他質(zhì)粒DNA再進行轉(zhuǎn)染。兩步轉(zhuǎn)染之間可以更換培養(yǎng)基。
注意事項
1. DNA和 NeuroMag溶液在使用前應(yīng)回復(fù)至室溫，并輕柔渦旋。每微克DNA使用3.5µL的NeuroMag并實驗需要來進優(yōu)化。
2. 神經(jīng)細胞系：建議在轉(zhuǎn)染前一天將細胞培養(yǎng)于玻片上。合適的細胞密度取決于增長率和細胞的條件。在轉(zhuǎn)染期間細胞不應(yīng)該少于60％的融合度（細胞覆蓋生長表面的百分比）。
3. 細胞密度是實現(xiàn)良好的轉(zhuǎn)染與低毒性的一個重要的參數(shù)，合適的細胞密度將取決于增長速度和細胞的培養(yǎng)條件。