在包裝重組病毒的過程中，質粒轉染是影響病毒包裝效果的重要一步。本試劑盒是基于CaPO₄法開發的病毒包裝試劑盒，在293T細胞中有非常好的轉染效果。

CaPO₄法最初是作為檢測病毒DNA傳染性的一種技術而發展起來的，由CaPO₄形成的沉淀通過增強DNA對細胞膜的吸附作用，促進哺乳動物細胞對DNA的攝取，從而達到轉染的目的。CaPO₄沉淀還限制了哺乳動物細胞內DNA酶對DNA的消化。

本試劑盒包含能夠快速、簡便、高效地對293T細胞進行質粒轉染的必要試劑，可同時用于慢病毒和逆轉錄病毒的包裝，可在100mm培養皿中進行20-50次轉染。Solution 1和Solution2用于形成CaPO₄沉淀；Solution3為本公司生產并經嚴格篩選的胎牛血清，用于病毒包裝過程中添加到細胞培養基中；Solution 4為病毒包裝增強試劑，可有效提過病毒包裝效率；Solution 5為病毒感染增強試劑，用于靶細胞感染；Controlplasmid為EGFP慢病毒質粒，用于包裝陽性對照病毒。

產品特點

?操作簡單、快速、高效

產品成分

注：Solution 1、Solution 2應避免反復凍融，請根據實驗情況分裝使用。

其他所需材料

超純水

293T (Acme-293T，東嶺生物)

DMEM高糖培養基

Fetal bovine serum (FBSV500，東嶺生物)

磷酸鹽緩沖液 (PBS: 137 mM NaCl, 2.6 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄, Adjust the pH to 7.4 with HCl)

操作流程

病毒包裝

1.提前一天消化293T細胞，重懸于37℃預熱的DMEM*培養基中（10%FBS，無抗生素，以下簡稱為D10），計數；

2.每個培養皿接種4.5×10^6細胞，10mlD10，輕輕晃動，將細胞*混勻；

3.在含5%CO₂培養箱中37℃培養過夜（轉染前細胞密度應達到60%-70%，可根據細胞生長速度對細胞接種量作調整）；

4.轉染前3h配制含有2.5% Solution 3的DMEM培養基（以下簡稱為D2.5，不含雙抗），37℃預熱備用；

5.轉染前2h吸去培養皿中培養基，每皿更換7ml上一步預熱的D2.5，放入培養箱中備用，注意避免細胞脫落；

6.準備渦旋儀，70%酒精擦拭消毒后置于無菌操作臺備用；

7.根據下表準備DNA混合液（該體系以慢病毒包裝載體pMD2G和psPAX為例，為1個100mm培養皿用量)：

8.邊渦旋邊逐滴加入50μl Solution 1，以充分混勻；
注：以上所用試劑均需恢復至室溫，陽性對照組用CMV-EGFP代替慢病毒表達載體。

9.在15ml離心管中準備等體積500μl Solution 2，在渦旋儀上快速渦旋，同時逐滴加入配制好的DNA混合液（該過程必須逐滴加入）；滴加結束后再渦旋5-10s；

10.將混合液室溫孵育20min；

11.同時，在待轉染細胞培養皿中加入8μl Solution 4，混勻后放于培養箱備用；

12.孵育結束后用移液槍或移液管輕輕混勻混合液，此時可見混合液略有渾濁；

13.將混合液逐滴均勻滴加至培養皿中，前后左右輕輕晃動培養皿，充分混勻；

14.將培養皿放于含3%CO₂培養箱中培養；

15.12-16h之后（不超過16h），37℃預熱DMEM無血清培養基（可用PBS代替）和D2.5；

16.吸去培養皿中培養基，用預熱的DMEM無血清培養基輕輕洗2次，10ml/次，之后加入10ml上步預熱的D2.5，混勻后置于含5%CO₂培養箱中37℃培養；

17.轉染36-48h后收集培養上清，2200rpm，4℃離心10min去除細胞碎片，置于4℃冰箱短期保存（不超過2天），或分裝后于-80℃長期保存。

18.收集的病毒上清可直接用于滴度測定，或濃縮后分裝保存；

本公司同時提供病毒濃縮試劑（貨號：GE-19002-50），可方便快捷高效地濃縮病毒，不需要超速離心機。