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應用文集｜電荷異構體分析“柱”力提高生物制藥關鍵質量屬性
本篇文集將會深入淺出介紹電荷異構體分析，進而“柱"力提高生物藥行業關鍵質量屬性。
用于生物分子分析的離子交換(IEX)色譜
提高生物治療性藥物電荷變異體分析
蛋白質由含有許多氨基酸的鏈組成，其中幾種氨基酸具有酸性或堿性側鏈基團。因此，蛋白質表面上的總電荷可以通過調節周圍溶液的 pH 來控制。等電點 pI 是蛋白質的凈電荷為中性時的 pH（正電荷數量等于負電荷數量）。如果 pH 低于 pI，則蛋白質總電荷為正，可以保留在帶負電荷的陽離子交換吸附劑上；如果 pH 高于 pI，則蛋白質總電荷為負，可以保留在陰離子交換吸附劑上。
圖 1. pH 值對蛋白質凈電荷的影響
由于大多數蛋白質所含的堿性氨基酸多于酸性氨基酸，因此大多數電荷異構體分離需要采用陽離子交換。然而，每種蛋白質都不相同，找到能夠實現所需佳分辨率的條件可能需要相當多的優化工作。強陽離子交換柱通常更易于使用，但對于單克隆抗體，弱陽離子交換柱可能是實現所需分離度的唯一途徑。
在開始方法開發之前，確定目標蛋白質的等電點 (pI) 是至關重要的。如果初始流動相條件的 pH 值過分接近蛋白質的 pI，蛋白質就不會保留在色譜柱上。pH 與主要物質的等電點之間的差距應為至少 0.5 至 2 個 pH 單位，具體取決于電荷異構體 pI 的差異。蛋白質可以通過鹽梯度（用高離子強度破壞蛋白質在色譜柱上的吸附）或 pH 梯度（蛋白質在 pH 等于 pI 時洗脫）洗脫。
圖 2. 陽離子交換的分離機制
基于離子電荷的分離通常在非變性條件下進行
離子交換是一種廣泛使用的方法，根據離子電荷的差異分離生物分子。它是一種溫和的非變性技術，不需要有機溶劑，因此經常用于表征天然或活性形式的蛋白質，也用于純化。
值得考慮采用一種能夠在方法開發過程中篩選幾種不同色譜柱的儀器。即使是離子強度和 pH 等方法條件的微小變化，也很難預測會產生怎樣的結果；這兩個因素都會影響蛋白質上的凈電荷，如果是弱離子交換色譜柱，還會影響色譜柱上的凈電荷。建議采用嚴格的“質量源于設計"方針。建議使用開發矩陣或系統化設計實驗的軟件。緩沖液顧問軟件可以利用 Agilent 1260 Infinity II 生物惰性液相色譜的四元 HPLC 泵功能，從而為方法開發節約大量時間。
因此，離子交換技術適用于分離具有不同等電點的蛋白質，但它在分離單個蛋白質的帶電異構體方面同樣很有價值。在越來越重要的生物制藥領域，蛋白質通過生物工程生產并從發酵反應中分離出來，帶電異構體表示著蛋白質的一級結構存在差異，因此帶電異構體的鑒定非常重要。一級結構的差異可能說明糖基化或降解途徑有所變化，例如 C 端殘基缺失或酰胺化/脫酰胺化作用。它們還可能導致穩定性或活性發生改變，并可能引起不良免疫反應。離子交換用于在開發過程中分離和量化電荷異構體，也用于生物治療藥物生產過程中的質量控制和質量保證。對于單克隆抗體 (mAb) 等大分子，還需要考慮分子的大小和結構（mAb 通常為 150 kD），特別是當色譜相互作用只會發生在表面電荷上時。
圖 3. 通過不同程度的氨基酸糖基化、脫酰胺化和氧化作用，以及重鏈的賴氨酸截短生成的單克隆抗體的電荷異構體
Agilent Bio MAb HPLC 色譜柱
從內到外的*性能
填料、涂層和鍵合能夠耐高壓，有助于實現更高的分離度和更快速的分離
親水聚合物層消除了大多數非特異性鍵合
高度均一、致密填裝的弱陽離子交換 (WCX) 功能團化學鍵合到親水聚合物層上
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安捷倫色譜柱選擇 - 離子交換(IEX)
此外，本篇應用文集中還包含利妥昔單抗創新藥物與生物仿制藥 mAb 的電荷異質性分析、使用 4D-LC/MS 對單克隆抗體電荷異構體進行全自動化表征等應用簡報供您查閱。
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