激光熒光共聚焦顯微鏡輸出的激光通過照明針孔反射到物鏡上，再通過分色鏡，最后聚焦在樣品表面。激光將與生物組織樣品中的熒光物質相互作用，產生熒光。一些熒光信號將以與入射光路相反的方向通過物鏡，然后進入分光鏡，最后被檢測器收集。由于針孔和樣品焦平面之間的共軛關系，焦平面外的反射信號會被針孔過濾掉，這使得共聚焦顯微鏡具有一定的色譜能力。穿過針孔的熒光信號具有很強的色譜能力。同時，由于光線強度較弱，需要使用靈敏度高的光電探測器進行檢測。光電倍增管可以將熒光信號放大并轉換為電信號（光電探測器輸出的電信號強度與熒光強度成正比），然后傳輸給計算機，計算機通過特定的處理方法將電信號轉換為圖像信息。
激光熒光共聚焦顯微鏡技術的主要應用范圍如下：
1、組織和細胞中的熒光定量測定
常用于單活細胞水平的定量分析，如原位雜交、腫瘤細胞凋亡觀察、DNA損傷和修復。
2、細胞間通訊的研究
用于研究縫隙連接通訊在胚胎發生、生殖發育、神經生物學、腫瘤發生等過程中的基本機制和功能，也可用于鑒定對縫隙連接有潛在毒性的化學物質。
3、細胞的物理和化學測定
可以定量、定性、定時、定點地測定溶酶體、線粒體、內質網、細胞骨架、結構蛋白、DNA、RNA、酶、受體分子等細胞內特定結構的含量、組成和分布。
4、細胞內鈣離子和pH值的動態分析
激光熒光共聚焦顯微鏡利用熒光探針和激光掃描共聚焦顯微鏡，可以測量活細胞內pH值和多種離子（Ca2+、K+、Na+、Mg2+）的濃度和變化。
5、三維圖像的重建
6、熒光漂白恢復技術
經過熒光漂白的細胞在熒光恢復過程中的變化，可以用來分析細胞的生物過程，如蛋白質的運輸、細胞膜上受體的流動和大分子的組裝。
