從1993年發(fā)現(xiàn)miRNA開始，有關(guān)miRNA的探索與發(fā)現(xiàn)就沒有停止過。miRNA雖只有很短的一段核苷酸，卻通過調(diào)控大量的靶基因，在基因表達中扮演了重要角色。小身體，大能量，說的就是它——microRNA（簡稱miRNA）。

miRNAs是一類長約20nt~24nt長度的單鏈小RNA，由細胞內(nèi)源產(chǎn)生的發(fā)卡（hairpin）結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄本加工而來。miRNAs的加工成熟是一個經(jīng)歷了細胞核到細胞質(zhì)空間轉(zhuǎn)變、多種酶和輔助蛋白協(xié)調(diào)完成的受到多層次調(diào)節(jié)的多步驟精密反應：1）DNA經(jīng)過轉(zhuǎn)錄形成初級產(chǎn)物pri-miRNA；2）pri-miRNA在核內(nèi)經(jīng)Drosha酶剪切形成miRNA前體pre-miRNA；3）pre-miRNA轉(zhuǎn)運至胞漿，經(jīng)Dicer酶剪切形成成熟的miRNA。miRNA的功能主要是沉默靶基因表達：在RISC沉默復合體協(xié)助下，miRNA與其靶基因mRNA的3'-UTR（3'端的非翻譯區(qū)）結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄或誘導mRNA降解，從而抑制蛋白翻譯。

因為miRNA的長度比較短，因此用常規(guī)的qPCR法很難對其直接定量。所以，在針對miRNA的PCR技術(shù)中，必須要延長待測miRNA的長度，構(gòu)建出一個足夠長的PCR模板，才能進一步應用PCR技術(shù)來定量分析。現(xiàn)在常用的對miRNA的定量方法主要有兩種，分別為莖環(huán)引物法、加尾法。

頸環(huán)引物法

需要自己設(shè)計一種特殊的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物，一般長度約為45bp。整個莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄引物由兩個部分組成：①通用的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，自身形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)不僅能夠有效地延長miRNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長度，同時它自身互補的構(gòu)象可以避免與其他同源基因結(jié)合，減少了非特異性擴增的幾率。② 5~8個與目的miRNA的3’端反向互補的堿基。莖環(huán)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄引物與miRNA 分子的3’端結(jié)合，并在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下進行反應，獲得人為加長的miRNA第1鏈cDNA。

莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄法利用可以正確折疊為莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物對miRNA進行反轉(zhuǎn)錄，以獲得人為加長后的miRNA cDNA第1鏈，然后利用合適的退火溫度將反轉(zhuǎn)錄引物的莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開并與PCR擴增的正反向引物結(jié)合，再通過染料法或探針法進行熒光定量PCR檢測。這種方法的特異性較高，但是對引物的要求也很高，需要引物在反轉(zhuǎn)錄階段形成莖環(huán)式的正確構(gòu)型，因此設(shè)計起來較為繁瑣和困難。而且針對同一樣本中不同的目的miRNA，就需要配制不同的逆轉(zhuǎn)錄體系。所以這種方法比較適合對樣本中少量幾個miRNA的精確定量檢測。

加尾法

加尾反轉(zhuǎn)錄法利用poly(A)聚合酶為成熟的miRNA加上poly(A)尾巴，然后用5’端帶通用標簽的Oligo-dT作為反轉(zhuǎn)錄引物，獲得人為加長的miRNA cDNA第1鏈，后用與通用標簽序列互補的反向引物進行染料法或者探針法的熒光定量PCR檢測。這種方法可以批量地將所有成熟miRNA加上poly(A)尾巴，然后進行反轉(zhuǎn)錄和檢測，無需繁瑣的引物設(shè)計，因此被很多實驗室采用。

Genecopoeia基于加尾法的All-in-One™ miRNA qRT-PCR 系列試劑盒和驗證引物，用于miRNA表達量的高效檢測。

All-in-One™ miRNA qRT-PCR 系列試劑盒包括All-in-One™ miRNA qRT-PCR Detection Kit（miRNA檢測試劑盒）、All-in-One™ miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit（miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒）和All-in-One™ miRNA qPCR Kit（miRNA定量試劑盒）。其中All-in-One™ qRT-PCR Detection Kit包括RT（逆轉(zhuǎn)錄）和qPCR（定量檢測）兩部分試劑，利用基于SYBR® Green的qPCR技術(shù)，可對低至20 pg的Total RNA（或者低至10 pg的small RNA）進行快速、準確定量。

miRNA qPCR定量檢測試劑盒：

多合一miRNA第1鏈cDNA合成試劑盒2.0，貨號：QP113；

多合一miRNA qRT-PCR檢測試劑盒2.0，貨號：QP115

All-in-One™ miRNA系列試劑靈敏度高、特異性強、性價比高

• 可對檢測低至20 pg的Total RNA（或者低至10 pg的small RNA）
• 僅檢測成熟miRNA

驗證引物

HsnRNA U6 primer，貨號：HmiRQP9001；

M丨snRNA U6 primer，貨號：MmiRQP9002

All-in-One™ miRNA 驗證引物

• 每條All-in-One™ miRNA 特異驗證引物均使用磚利算法設(shè)計并經(jīng)過實驗確證。
• 在miRNA定量PCR試驗中，該系列驗證引物與基于SYBR® Green I 的All-in-One™ miRNA qRT-PCR Kit配套使用，性能可靠，重復性好。

引物驗證結(jié)果

All-in-One™ miRNA qPCR pimer經(jīng)驗證產(chǎn)生單一擴增產(chǎn)物，融解曲線均呈單一銳鋒，電泳條帶均呈單一條帶，且與目標miRNA相符。由10種人組織混合樣本的總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成的cDNA作為引物驗證的模板。qPCR反應由終濃度0.2 µM的引物和All-in-One™ qPCR Mix配合完成。（A）驗證結(jié)果的擴增曲線，（B）驗證結(jié)果的熔解曲線。