您好, 歡迎來到化工儀器網
8
膠原酶消化法—培養臍帶間充質干細胞
人臍帶間充質干細胞具有高度分化潛能，基因穩定、不易突變，不會引起腫瘤；無需配型、無排異，廣泛應用于疾病治療及抗衰老研究。目前，在美容行業及針對亞健康群體的應用，也越來越引人注目。
臍帶間充質干細胞臍帶是由包膜、華通氏膠、臍靜脈、臍動脈臍構成。臍帶間充質干細胞存在于華通氏膠中。
由于存在數量少，用膠原酶消化后獲取的細胞量很少。另外，一般的膠原酶消化法獲取細胞時，膠原酶對細胞的傷害較大，培養出來的細胞狀態差。貼塊方法培養人臍帶間充質細胞是普遍采用的方法，但是，細胞從組織中爬出來的時間長（10-20天，甚至更長）。我們經過不斷的摸索，找出一個用膠原酶消化獲取臍帶間充質干細胞的方法。
具體操作方法如下：
① 在剪斷連接嬰兒端和母親的臍帶后，立刻用臍帶夾夾住，防止內部污染。裝入無菌袋（容器）中，送進實驗室。
② 在生物安全柜或超凈工作臺內，取出臍帶，連同臍帶夾用75%的酒精泡2min（50ml離心管或250px皿）。如果臍帶較長，無法裝入容器，可以把臍帶剪成250px左右，但是剪斷之前一定要用臍帶夾加好，防止酒精進入臍帶內部，損傷細胞。
③ 用酒精處理完，迅速移入裝有PBS或生理鹽水的容器中浸泡清洗2次，每次2min即可。
④ 剪掉臍帶夾，把臍帶剪成2-75px段，用剪刀從臍靜脈內側剖開臍帶，用帶齒鑷子（臍帶組織比較滑，用帶齒鑷子好操作）把臍靜脈、臍動脈以及臍帶包膜去除，防止雜細胞混入。
⑤ 用剪刀剪碎臍帶組織，0.1%Ⅱ型膠原酶（稀釋液用DMEM/F12）過夜消化，4℃過夜消化。
⑥ 第二天，把未消化完的組織倒到100目（80目、160目都可以）的鋼制篩網上（鋼制網篩，承載的組織量大，便于操作），用PBS（或生理鹽水）多次沖洗，盡可能去掉附著在組織表面上的膠原酶。后用*培養基沖洗1-2次，去除PBS（或生理鹽水）。
⑦ 倒入皿中(放入瓶中操作不方便)，在未消化組織塊上加入少量培養基培養（6ml加2-3ml、10ml加3-4ml）（其目的是減少殘存膠原酶對細胞的傷害）。次日，組織塊*消失（被浸入到組織中的膠原酶消化掉了），細胞*被分散開，顯微鏡下可以看到已經消化完的組織中有許多被分散的細胞。再加入少量培養基（150px加2-3ml、250px加4-5ml）加入培養基后繼續培養。
⑧ 兩天后繼續添加少量培養基（150px加2-3ml、250px加4-5ml）培養。
⑨ 一兩天后，細胞數量會有明顯增加（許多成集落生長），分別移入兩個50ml離心管中，加入PBS（或生理鹽水）至50ml，混勻，2500rpm、6min離心。
⑩ 用5-6ml（根據細胞量）*培養基重懸，1000rpm、6min離心，鋪到T25瓶中，加入5ml*培養基培養。
? 三天后，可以換液或添加3-4ml*培養基繼續培養。之后每三天換液，直至長滿（70%以上即可傳代）
啟示注意事項：
① 此方法具有易于操作，培養時間短的特點。
② 用膠原酶消化臍帶，37℃下，數小時以內基本能夠把臍帶消化完，但同時對細胞的傷害較大。膠原酶能夠浸透到臍帶組織內部，低濃度的膠原酶從內到外消化組織，對細胞傷害較小。（胰蛋白酶對臍帶組織消化效果非常差）
③ *消化完組織，并沒有單獨把細胞分離出來的原因，是臍帶膠原成分（粘稠）會促使臍帶間充質干細胞增殖。多數細胞懸浮在膠原當中，以集落方式增殖，這是鋪到瓶中，細胞保持良好狀態的主要原因。
④ 培養臍帶間充質干細胞時，不要用帶有血清的培養基（血清會促進細胞分化），而是用干細胞培養基。傳代也盡量不用胰蛋白酶消化（胰蛋白酶對臍帶間充質干細胞傷害大），應該采用消化液，能夠保證細胞更多的傳代次數。