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抗血清中去除交叉反應(yīng)性抗體實驗

閱讀：2042 發(fā)布時間：2019/4/3

抗血清中去除交叉反應(yīng)性抗體實驗

試劑、試劑盒	封閉緩沖液封閉液細(xì)胞懸浮緩沖液抗體LB 培養(yǎng)基
儀器、耗材	Sorval GSA 轉(zhuǎn)子或相當(dāng)轉(zhuǎn)子適用于處理細(xì)菌的超聲波破碎儀大腸桿菌 Y1090 hsdR
實驗步驟	材料緩沖液和溶液貯存緩沖液和試劑的組分請見時錄 12。將貯存液稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛取?br /> 封閉緩沖液 10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0) 150 mmol/L NaCl 0.05%(V/V)Tween-20 封閉液（1%m/V 明膠,3%m/V 牛血清白蛋白，或 5%m/V 脫脂奶粉）這些封閉試劑的優(yōu)點，不同實驗室備執(zhí)一詞。我們建議使用者進(jìn)行預(yù)試驗確定哪種封閉液與所選擇的抗體和第二抗體匹配you。封閉液可以貯存于 4°C，重復(fù)使用數(shù)次。加人終濃度為 0.05%(m/V）的die氮化鈉用以抑制微生物的生長。細(xì)胞懸浮緩沖液 50 mmol/L Tris-Cl(pH8.0) 10 mmol/L EDTA(pH8.0) 過濾除菌，以 50 ml 等分后貯存于 4°C。抗體制備用于文庫篩選的抗體培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基離心機和轉(zhuǎn)子 Sorval GSA 轉(zhuǎn)子或相當(dāng)轉(zhuǎn)子設(shè)備適用于處理細(xì)菌的超聲波破碎儀載體和菌株大腸桿菌 Y1090 hsdR 該菌株可以從 Stratagene,Life Technologies 或 ATCC(www，atcc.org) 獲得。抗血清中去除交叉反應(yīng)性抗體實驗方法 1. 在 LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng) 100 ml 大腸桿菌 Y1090 hsdR 株達(dá)到飽和。 2. 于 4°C 以 5000 g 離心10min 收獲細(xì)菌。 3. 細(xì)菌重懸于 3 ml 細(xì)菌懸浮緩沖液中。反復(fù)凍融數(shù)次，再于 0°C 用大功率超聲波處理 6 次，每次 20s。 4. 提取液于 4°C 以 12000g 離心 10 min, 將上清液轉(zhuǎn)移到另一試管內(nèi)，所得裂解液貯存于-20°C。 5. 使用裂解液前先用封閉液以 1:10 稀釋用于篩選的抗體制劑。 6. 每毫升抗血清中加入 0.5 ml 大腸桿菌裂解液。置室溫緩慢搖動溫育 4 h。處理后的抗體加入 0.05% die氮化鈉，保存于 4°C 以備免疫篩選時使用。

試劑、試劑盒

封閉緩沖液封閉液細(xì)胞懸浮緩沖液抗體LB 培養(yǎng)基

儀器、耗材

Sorval GSA 轉(zhuǎn)子或相當(dāng)轉(zhuǎn)子適用于處理細(xì)菌的超聲波破碎儀大腸桿菌 Y1090 hsdR

實驗步驟

材料

緩沖液和溶液

貯存緩沖液和試劑的組分請見時錄 12。
將貯存液稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛取?br />
封閉緩沖液

10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
150 mmol/L NaCl
0.05%(V/V)Tween-20

封閉液（1%m/V 明膠,3%m/V 牛血清白蛋白，或 5%m/V 脫脂奶粉）
這些封閉試劑的優(yōu)點，不同實驗室備執(zhí)一詞。我們建議使用者進(jìn)行預(yù)試驗確定哪種封閉液與所選擇的抗體和第二抗體匹配you。封閉液可以貯存于 4°C，重復(fù)使用數(shù)次。加人終濃度為 0.05%(m/V）的die氮化鈉用以抑制微生物的生長。

細(xì)胞懸浮緩沖液

50 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
10 mmol/L EDTA(pH8.0)
過濾除菌，以 50 ml 等分后貯存于 4°C。

抗體

制備用于文庫篩選的抗體

培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基

離心機和轉(zhuǎn)子

Sorval GSA 轉(zhuǎn)子或相當(dāng)轉(zhuǎn)子

設(shè)備

適用于處理細(xì)菌的超聲波破碎儀

載體和菌株

大腸桿菌 Y1090 hsdR
該菌株可以從 Stratagene,Life Technologies 或 ATCC(www，atcc.org) 獲得。

抗血清中去除交叉反應(yīng)性抗體實驗
方法

1. 在 LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng) 100 ml 大腸桿菌 Y1090 hsdR 株達(dá)到飽和。

2. 于 4°C 以 5000 g 離心10min 收獲細(xì)菌。

3. 細(xì)菌重懸于 3 ml 細(xì)菌懸浮緩沖液中。反復(fù)凍融數(shù)次，再于 0°C 用大功率超聲波處理 6 次，每次 20s。

4. 提取液于 4°C 以 12000g 離心 10 min, 將上清液轉(zhuǎn)移到另一試管內(nèi)，所得裂解液貯存于-20°C。

5. 使用裂解液前先用封閉液以 1:10 稀釋用于篩選的抗體制劑。

6. 每毫升抗血清中加入 0.5 ml 大腸桿菌裂解液。置室溫緩慢搖動溫育 4 h。處理后的抗體加入 0.05% die氮化鈉，保存于 4°C 以備免疫篩選時使用。

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