技術(shù)服務(wù)介紹

雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)是以熒光素(luciferin) 為底物來(lái)檢測(cè)螢火蛟光素酶(fireflyluciferase)活性的一種報(bào)告系統(tǒng)。熒光素酶可以催化Iuciferin氧化成oyluciferin, 在luciferin氧化的過(guò)程中，會(huì)發(fā)出生物熒光(bioluminescence) ，可通過(guò)熒光測(cè)定儀設(shè)備測(cè)定luciferin氧化過(guò)程中釋放的生物熒光，常應(yīng)用于啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控及miRNA靶基因驗(yàn)證等向研究。

雙熒光素酶通常是指螢火蛟光素酶和海腎熒光素。其中熒火蛟光素是從甲蟲(chóng)(Photinuspyralis)中分離得到，分子量為61kDa;而海腎(Renilla) 熒光素酶則是從海腎(Renillareniformis)中分離,分子量為36kDa。這兩種酶的區(qū)別之一是他們的底物和輔因子不同:螢火蟲(chóng)熒光素酶需要熒光素、氧氣、 ATP和鎂離子同時(shí)存在才能發(fā)光;而海腎熒光素酶僅需要腔腸素(coelenterazine)和氧氣。螢火熒光素酶和海腎熒光素酶的區(qū)別之二是發(fā)光的顏色不同:螢火蟲(chóng)熒光素酶產(chǎn)生的光顏色呈現(xiàn)黃綠色,波長(zhǎng)550-570nm;而海腎熒光素酶產(chǎn)生藍(lán)光，波長(zhǎng)480nm。正是由于這兩種酶的底物和發(fā)光顏色不同，所以在雙報(bào)告實(shí)驗(yàn)中得到廣泛應(yīng)用。

雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)優(yōu)勢(shì):單報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)往往會(huì)受到各種實(shí)驗(yàn)條件的影響，而雙報(bào)告基因則通過(guò)共轉(zhuǎn)染的"對(duì)照"作為內(nèi)參為試驗(yàn)提供-基準(zhǔn)線, 從而可以在zuidachengdu上減小細(xì)胞活性和轉(zhuǎn)染效率等外在因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，使得數(shù)據(jù)結(jié)果更為可信。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)常用的載體有兩種策略。第一種是兩種熒光素分別位于兩個(gè)載體上,第二種是兩種熒光素酶位于同一個(gè)載體上。以第一種為例，這兩種載體分別為pMIR REPORT miRNA載體和pRL-TK載體。經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)，pMIR-REPORT miRNA載體是由Ambion開(kāi)發(fā)的載體，它用來(lái)克隆插入miRNA靶序列，評(píng)估細(xì)胞內(nèi)miRNA功能的載體。

另外的一個(gè)載體是pRL-TK載體，這個(gè)載體是由Promega開(kāi)發(fā)的，pRL-TK是海腎熒光素酶報(bào)告載體，含有SV40增強(qiáng)子，pMIR-REPORT miRNA這個(gè)載體主要是用于評(píng)估m(xù)iRNA與靶基因3’UTR的結(jié)合，靶基因的3’UTR放在熒光素酶的后面，這個(gè)熒光素酶是熒火蟲(chóng)熒光素酶，而pRL-TK這個(gè)載體則表達(dá)海腎熒光素酶，將這兩個(gè)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染進(jìn)入293細(xì)胞中來(lái)檢測(cè)熒光時(shí)，pRL-TK這個(gè)質(zhì)粒起到一個(gè)內(nèi)參的作用。