9PCR實驗的污染來源都有：樣本間交叉污染、實驗試劑污染、擴增產物污染
防止實驗污染都有哪些措施？
對于低流行地區，PCR檢測人員經過嚴格培訓上崗后，核酸污染的風險相對較小，但在疫區超負荷工作時，就可能會遇到核酸污染的問題，可通過以下措施降低污染機會：
正確佩戴手套：手套未緊密貼合拇指、食指和中指，在進行開蓋操作時容易發生交叉污染。
正確使用生物安全柜：簡單、整潔、避免通風口堵塞；操作前后紫外線照射，消毒劑隨手可及；廢液缸里有1/3體積的含氯消毒液，并且及時清理廢液缸，保證廢物不超過廢液缸體積的2/3。
核酸提取儀去污染：每天多批次檢測時，在每一批次檢測完以后必須用75%的乙醇和核酸去除劑對儀器進行去污染。
重視通風：不定期對房間進行通風，每次至少持續30min。
PCR擴增區去污染：PCR反應管必須蓋緊，避免擴增后的核酸對環境的污染。
實驗室隨手可及的消毒劑。
常規PCR Kit （經典法）(不含Taq酶）
特點
1.內控對照為獨立包裝，遵循歐洲藥典和日本藥典操作流程。
2.高特異性，僅一條陽性對照條帶，即可涵蓋所有可能感染細胞的支原體物種。操作簡單，
易于觀察。
3. 高靈敏度，若PCR反應體系加入10μl樣本，支原體檢測限度為≤5或≤10CFU。
(詳見下文“(2)Venor® Gem Classic Kit 10種常見支原體檢測限“)
4.歐洲藥典要求的26種支原體均可檢出。該試劑盒可檢測出1種脲原體、7種無膽甾原體和85種支原體，與細菌和真核DNA無交叉反應。
5.試劑盒中不含Taq酶，可另外購買。推薦使用德國MB公司專用Taq酶。(貨號: 53-1050)
Venor® Gem Classic Kit
10種常見支原體檢測限
操作步驟
第1步：樣本處理
a. 細胞培養上清
b. 生物藥或需遵循藥典的樣本
說明：①樣品基質可能會影響檢測的靈敏度。收集和篩選更高的樣品量可提高測定靈敏度。
②細胞培養物樣本含豐富的DNA酶，在低溫下也能降解支原DNA，影響檢測靈敏度。
建議：樣本做DNA抽提處理，實現最高靈敏度。
推薦：德國MB公司生產的專用支原體DNA提取試劑盒，Venor® Gem Sample Preparation Kit。該DNA抽提試 劑盒已經過廣泛驗證。
第2步：試劑制備
第3步：PCR體系建立
a. 細胞培養上清
b. 生物藥或需遵循藥典的樣本
第4步：啟動PCR反應
第5步：電泳結果分析
191bp為內控對照條帶，表明PCR反應正常。
當樣本存在支原體污染時，由于內控對照與支原體DNA存在競爭，內控對照條帶變弱（例如支原體DNA＞103拷貝）。
陽性對照中支原體DNA＞104拷貝，內控對照條帶會*消失。
可能在80-90bp存在引物自退火形成的條帶，此條帶不影響檢測結果。
如果待測樣本對PCR產生抑制，則內控對照條帶變弱（和陰性對照相比），此時應先進行DNA抽提（推薦使用：Venor® Gem Sample Preparation Kit 支原體DNA抽提試劑盒，詳見第25頁），然后再檢測。
儲存條件
2~8℃至少6個月。復溶后在-18℃保存。
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