隨著蛋白質(zhì)化學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，用于各種疾病治療的蛋白質(zhì)類藥物的研制和應(yīng)用已成為生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的熱點(diǎn)。多肽和蛋白類藥物副作用小、活性強(qiáng)，并具有標(biāo)本兼治的功效。當(dāng)我們純化蛋白時(shí)，最重要的就是要保持蛋白在純化過程中不能失活，或者是盡量降低純化過程對(duì)蛋白活性帶來(lái)的損失。因此，在設(shè)計(jì)緩沖液時(shí)應(yīng)考慮以下幾個(gè)因素：pH值、緩沖體系、鹽離子、還原劑和穩(wěn)定劑。
pH值
很多實(shí)驗(yàn)的pH值設(shè)定在7.4以模仿生物條件，但如果目的蛋白在此條件下不穩(wěn)定，就需要改變pH值使它在溶液中處于可溶且不會(huì)降解的狀態(tài)。當(dāng)溶液pH值在蛋白等電點(diǎn)pI附近時(shí)，其在溶液中會(huì)表現(xiàn)得不易溶解，因?yàn)榇藭r(shí)蛋白表面沒有凈電荷，從而容易聚集。可以用ExPASy網(wǎng)站的ProtParam工具快速簡(jiǎn)便地計(jì)算蛋白等電點(diǎn)pI值，只要提交蛋白序列即可。
緩沖體系
首先我們要確保所選擇的緩沖體系在設(shè)定的pH值上確實(shí)具有緩沖能力，其解離常數(shù)pKa值應(yīng)該在所設(shè)定的pH值上下一個(gè)單位內(nèi)。
再者是確保緩沖液濃度足夠高以達(dá)到實(shí)際緩沖溶液的作用。一般會(huì)選擇的濃度是20~100mM。需要注意的是所使用的緩沖體系不能影響蛋白活性，比如磷酸鹽會(huì)抑制激酶的活性，所以反應(yīng)前應(yīng)*地透析掉。
此外，一些緩沖體系對(duì)溫度非常敏感，例如Tris-HCl緩沖液，如果在25℃時(shí)將緩沖體系調(diào)至pH值8，其pH值將在5℃時(shí)增加到8.58，在37℃時(shí)降到7.71，所以，如果不是在25℃下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，就應(yīng)該考慮到這個(gè)pH值可能在實(shí)驗(yàn)條件中不適用。
鹽離子
許多緩沖液中含有NaCl，以幫助保持蛋白的可溶性和模擬生理?xiàng)l件，濃度一般為150mM，但在不同的蛋白純化步驟中，可能需要不同的鹽離子濃度。離子交換層析一般是低鹽結(jié)合、高鹽洗脫，結(jié)合時(shí)需要降低鹽濃度是為了避免高離子強(qiáng)度下，鹽離子與蛋白競(jìng)爭(zhēng)與填料結(jié)合，防止蛋白從離子交換柱中流穿，從而使柱子能夠結(jié)合目的蛋白；而疏水層析一般為高鹽結(jié)合、低鹽洗脫。
還原劑
如果目標(biāo)蛋白含有半胱氨酸殘基，可能會(huì)出現(xiàn)殘基間的氧化問題，并可能導(dǎo)致蛋白聚集。為了防止這一點(diǎn)，往往會(huì)在緩沖液中添加一些還原劑，如DTT、TCEP和巰基乙醇。
TCEP是這三個(gè)還原劑中z穩(wěn)定的，但也是最貴的。通常純化過程中的緩沖液里會(huì)添加DTT，在最后保存酶液的緩沖液里添加TCEP。還原劑濃度一般是5~10mM，它應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于蛋白濃度。DTT和巰基乙醇在室溫下就會(huì)降解，所以需要將添加了還原劑的緩沖液處于低溫保藏，或者在使用時(shí)再添加還原劑。
使用還原劑時(shí)要確保柱材料能夠與之相容，比如高濃度的還原劑會(huì)脫掉鎳柱中的鎳，并使柱子顏色變深呈棕色，雖然鎳柱能進(jìn)行再生，但柱載量將會(huì)受到很大影響。
穩(wěn)定劑
添加一些穩(wěn)定劑到緩沖液中，能幫助提高蛋白純化時(shí)的蛋白溶解度和穩(wěn)定性。在緩沖液中添加惰性蛋白BSA在某種程度上可以穩(wěn)定目標(biāo)蛋白，但必須確保這些加入的穩(wěn)定劑不干擾實(shí)驗(yàn)；有時(shí)添加甘油、聚乙二醇等以增加緩沖液粘度，有助于防止蛋白聚集；另外，使用少量的表面活性劑和一些離子化合物如硫酸鹽、氨基酸、檸檬酸等可以避免蛋白間的離子相互作用，幫助蛋白溶解。
以上就是在設(shè)計(jì)緩沖液時(shí)應(yīng)該考慮的五個(gè)因素，為了保持蛋白在純化過程中的活性和穩(wěn)定性，我們應(yīng)當(dāng)設(shè)定最佳實(shí)驗(yàn)方案。
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