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#1 色譜柱的技術(shù)都有哪些？比如，封尾等，這些技術(shù)在應(yīng)用時(shí)都體現(xiàn)在哪里？

答：色譜柱技術(shù)包括填料技術(shù)，封尾技術(shù)和裝柱技術(shù)等，填料技術(shù)自不待言，填料的差異對(duì)色譜柱分離性能和選擇性有決定性影響，色譜填料的鍵合相密度的不同也會(huì)影響到填料表面硅羥基裸露的多少，進(jìn)而影響填料的選擇性。封尾技術(shù)中用到的封尾試劑的差異也會(huì)對(duì)色譜柱的性質(zhì)產(chǎn)生很大的影響，如體現(xiàn)在色譜填料的pH耐受范圍，水相耐受范圍，極性強(qiáng)弱等。裝柱技術(shù)也沒有想象中的這么簡(jiǎn)單，不同固定相、不同粒徑、不同柱管內(nèi)徑和長度，裝柱工藝都有所不同，要裝出緊密、穩(wěn)定、均一的柱床，更多是一門藝術(shù)，需要經(jīng)驗(yàn)積累。

#2 柱子在什么情況下需要更換篩板呢？更換篩板會(huì)使色譜柱使用壽命減少嗎？

答：色譜柱篩板被樣品污染，或被柱頭端填料污染了，就需要更換篩板，并且更換柱頭端被污染的填料。月旭科技不建議客戶自行拆開色譜柱柱頭螺絲，最好是寄回廠家維修。色譜柱更換篩板和柱頭填料不會(huì)對(duì)色譜柱使用壽命造成影響。

#3 如果柱子取下來放置一段時(shí)間，需要做什么保護(hù)嗎？

答：對(duì)一般的反相柱，也就是洗干凈后置于純甲醇（乙腈）或者是80%左右的甲醇（乙腈）水中，然后用堵頭塞緊柱兩頭，以免保存溶劑揮發(fā)，下次使用前拿出來重新活化一下。

#4 做實(shí)驗(yàn)，是用保護(hù)柱好？還是不用保護(hù)柱好？

答：應(yīng)該這樣說，加上保護(hù)柱，肯定有利于保護(hù)色譜柱不受一些顆粒物質(zhì)的堵塞，且如果保護(hù)柱接得好并且盡量控制其匹配性和經(jīng)常更換，對(duì)分離度和柱效的影響并不大。只是在選擇保護(hù)柱柱芯時(shí)千萬注意，選擇和分析柱填料相一致的保護(hù)柱柱芯，否則極有可能影響化合物的分析。

#5 用的是四元梯度泵：A：50%甲醇；B：50%水，經(jīng)常出現(xiàn)停或進(jìn)氣泡這是什么原因？

答：水/甲醇比例在55/45時(shí)，黏度和柱壓有個(gè)極大值。50/50接近了這個(gè)極值，柱壓是比較高的。但影響柱壓最大的還是填料粒徑和色譜柱內(nèi)徑。系統(tǒng)壓力高，可能會(huì)因溶劑泵中的過濾頭供液速度跟不上而導(dǎo)致氣泡進(jìn)入系統(tǒng)，停機(jī)也應(yīng)該是因?yàn)闅馀葸M(jìn)入壓力下降的原因，可考慮更換液體通量更大的過濾頭。

#6 填料方法的前三種都是濕法嗎，能不能對(duì)四種填充方法做一個(gè)簡(jiǎn)短的說明？

答：資料顯示：在正常條件下，填料粒度＞20µm時(shí)，干法填充制備柱較為合適；顆粒＜20µm時(shí)，濕法填充較為理想。填充方法一般有4種：

① 高壓勻漿法，多用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充；

② 徑向加壓法，Waters專L；

③ 軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱，如DAC；

④ 干法柱填充的技術(shù)性很強(qiáng)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用已填充好的商品柱。

#7 如果不使用不銹鋼接頭，而改用peek頭，是否可以完Q解決接頭匹配問題？

答：色譜柱接頭其實(shí)大都不是色譜柱廠商自己生產(chǎn)的，供貨商有多個(gè)，Valco，Parker等，他們的標(biāo)準(zhǔn)相互之間不統(tǒng)一，那色譜柱接頭的標(biāo)準(zhǔn)就統(tǒng)一不起來。不過一般這個(gè)問題也不難解決的，換個(gè)接頭就可以了，而且現(xiàn)在有了萬用接頭，可以配所有不同類型的柱頭，不泄露，連接死體積又很小。

#8 做多肽藥物時(shí)，流動(dòng)相A：0.1%或者1%TFA水溶液，流動(dòng)相B：0.1%或者1%TFA乙腈溶液，基線波動(dòng)大，流動(dòng)相中不加TFA時(shí)見不到主峰，基線良好。

答：很明顯這是TFA加入流動(dòng)相里，走梯度情況下造成的基線波動(dòng)。TFA優(yōu)于其他離子修飾劑的原因是它容易揮發(fā)，可以方便地從制備樣品中除去。另一方面，TFA的紫外最大吸收峰低于200nm，因此在低波長下容易出現(xiàn)基線干擾。解決辦法可以建議在其中一瓶流動(dòng)相中等比例加入另一瓶流動(dòng)相的溶液。

#9 三lv乙酸流動(dòng)相使用完之后如何沖洗色譜柱比較好？

答：流動(dòng)相加入TFA，在反相色譜分離多肽和蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)中，使用TFA作為離子對(duì)試劑是常見的手段。流動(dòng)相中的TFA通過與疏水鍵合相和殘留的極性表面以多種模式相互作用，來改善峰形、克服峰展寬和拖尾問題。因?yàn)門FA也屬于一種離子對(duì)試劑，因此最好也使用沖洗離子對(duì)試劑的步驟沖洗色譜柱，即50%甲醇水低流速反沖過夜。若是分析蛋白樣品，建議按照10%甲醇--乙腈/水/TFA (50/50/0.1)，低流速反沖過夜。

#10 藥典上介紹測(cè)定分子量大于2000的樣品，選擇柱子填料的孔徑為300Å，300Å與100Å對(duì)結(jié)果有什么區(qū)別？

答：在做多肽類樣品的時(shí)候，300Å孔徑的填料相對(duì)100Å孔徑肯定要選擇性好點(diǎn)，也就是分離度相對(duì)比較好點(diǎn)。因?yàn)榈鞍追肿恿浚?000，會(huì)對(duì)進(jìn)入120Å填料的孔造成困難，從而進(jìn)不了孔，沒有保留，就在填料表面，隨著溶劑一同出峰。我們一般選擇填料的時(shí)候，要求孔徑至少是分子直徑的三倍，從而保證分子可以進(jìn)入到孔內(nèi)。