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上海嘉鵬
主營產品： 超微量分光光度計,核酸蛋白檢測儀,超微量紫外分光光度計,nano光度計,超微量核酸蛋白檢測儀 |
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2018-3-6 閱讀(4326)
核酸純化在分子生物學實驗室已經廣泛應用。怎樣獲得高質量、高純度的DNA或RNA樣品對下游實驗的順利進行至關重要，因此，對純化后的核酸進行鑒定也是*的步驟。本文簡單的回顧學習一下核酸鑒定的方法。
核酸鑒定包括：濃度/純度鑒定+完整性鑒定
1.濃度/純度鑒定
（1）紫外分光光度計：
原理：由于核酸中的堿基都具有共軛雙鍵，所以具有紫外光吸收性質。核酸在紫外光譜區有一條典型的吸收曲線，其吸收高峰在260nm處，吸收低谷在230nm處。蛋白質在紫外區的吸收高峰在280nm處，所以核酸的紫外吸收光譜數據是鑒定核酸的重要依據之一。
由于核苷酸zui大吸收波長為260nm,根據朗伯-比爾定律可計算出在波長260nm的紫外線下，1個OD值的光密度大約相當于50µg/ml的雙鏈DNA， 40µg/ml的單鏈RNA。紫外分光光度法只適用于測定濃度大于0.25µg/ml的核酸溶液。
計算公式:
dsDNA（µg/µl）=OD260x50x稀釋倍數/1000
RNA（µg/µl）=OD260x40x稀釋倍數/1000
純凈的DNA OD260/OD280=1.8，制備的樣品DNA比值在1.7-1.9，若洗脫時不使用洗脫緩沖液而使用去離子水，比值會偏低，因為PH值和離子存在會影響光的吸收值。
當OD260/OD280< 1.7，表明蛋白質含量較高，可用利用酚、異戊醇抽提，再用乙醇沉淀去除。
當OD260/OD280> 2.0，表明RNA含量較高。可用RNaseA消化后再進行純化。
OD260/OD230的值，一般不小于2.0，若小于2.0，表明有碳水化合物、鹽類或有機試劑污染。
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