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青島捷世康生物科技有限公司
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ATP 含量試劑盒說明書

時間:2016/5/3閱讀:2295
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ATP 含量試劑盒說明書

測定意義:

ATP 廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中是生物能量通貨能荷是描述細胞能量 代謝狀態的主要參數。測定 ATP 含量并且計算能荷能夠反映能量代謝狀態。

測定原理:

ATP  254 nm 下有吸收峰可以利用液相色譜法測定其含量。

需自備的實驗用品:

液相色譜儀、低速離心機、溶劑抽濾裝置、針頭式過濾器水系50 個0.22μm、濾 膜水系和有機系各 1 個0.45μmC18 柱4.6 ×150 mm、可調式移液器、樣品瓶50 個2mL、甲醇色譜級300 mL和蒸餾水。

試劑的組成和配制:

試劑一液體 60mL×1 瓶4℃保存 

試劑二液體 60mL×1 瓶4℃保存

試劑三粉劑 1×1 瓶粉劑 2×1 瓶4℃保存臨用前用少量蒸餾水將粉劑 1 和粉劑 2 溶解 后倒入 1000mL 容量瓶中用蒸餾水定容至 1000mL形成流動相緩沖液基質試劑瓶 中的粉劑要沖洗干凈, 4℃可保存 1 周

試劑四ATP 標準品 5mg×1 支-20℃保存。臨用前加入 1mL 蒸餾水配成 5mg/mL 溶液 配好后-20℃可保存 1 周.

實驗前的準備工作:

1、將蒸餾水 1000 mL、流動相緩沖液基質 1000 mL 和甲醇 300 mL  0.45 μm 的濾膜抽濾 以除去溶劑中的雜質防止堵塞色譜柱。蒸餾水和緩沖液基質用水系濾膜抽濾甲醇 用有機系濾膜抽濾

2、流動相的配制將抽濾完畢的流動相緩沖液基質 1000 mL 與甲醇配比為 99.90.1v/v), 即取 999mL 緩沖液基質與 1mL 甲醇混合。

3、將抽濾完畢的甲醇和蒸餾水配比成 100%的甲醇 10%的甲醇蒸餾水各 250 mL 2 和 3 中的溶劑超聲 30 分鐘以脫去溶劑中的氣泡防止堵塞色譜柱。

ATP 的提取:

1、組織的處理準確稱取組織重量 0.1g加入 1mL 試劑一提取 ATP 4000g 常溫離心 15 min取上清液加入等體積的試劑二混勻4000 g 常溫離心 15 min取上清0.22μm 水系微孔濾膜過濾后冰上放置待測。

2、細胞處理收集約 30 mL 細胞離心菌體經干燥后加入 1 mL 試劑一超聲破壁細胞(950 W30%15 min工作 1 s 間隔 2 s)4000 g 常溫離心 15 min取上清液加入等體積的 試劑二混勻4000 g 常溫離心 15 min取上清0.22μm 水系微孔濾膜過濾后冰上放置 待測。

ATP 含量測定操作步驟:

  1. 開啟電腦、檢測器和泵安裝上色譜柱打開 empower 軟件在方法組中設置進樣量 20 μL流速 1 mL/min保留時間 10min檢測波長 254nm,設置完畢保存方法組。 
  2. 100%的甲醇、10%的甲醇、蒸餾水按甲醇濃度從大到小的順序洗色譜柱 30min。 
  3. 用流動相洗柱子待基線穩定后開始加樣。 
  4. 加入標準品 20 μL10min 內可分離 ATP ATP 的保留時間在 3min 左右,(柱子不同 保留時間有差異),計算不同濃度的 ATP 標準品的峰面積。 
  5. 加入樣品 20 μL在相應保留時間處檢測 ATP 的峰面積。

ATP 含量的計算:

5mg/ml  ATP 標準品用蒸餾水分別稀釋成 100 μg/ml80 μg/ml60 μg /ml40 μg /ml和20 μg /ml  ATP 標準品溶液以標準品濃度μg/ml為橫坐標峰面積為縱坐標分別計 ATP 標準曲線。

   來源于青島捷世康:www.jisskang。。com

標準品的稀釋倍數要根據樣品中 ATP 濃度確定樣品中 ATP 的峰面積必須落在不同濃 度的 ATP 標準品的峰面積之內該標準品稀釋倍數只是一個參考。

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