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青島捷世康生物科技有限公司
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線粒體復合體Ⅲ試劑盒說明書1

時間:2017/9/4閱讀:1456
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線粒體復合體試劑盒說明書

 

分光光度法 25 /24

 

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義

 

線粒體復合體EC 1.10.2.2又稱 CoQ-細胞色素 C 還原酶,廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞的線粒體中,是線粒體呼吸電子傳遞鏈主路和支路的共有成分,負責把還原型 CoQ 的氫傳遞給細胞色素 C,生成還原型細胞色素 C

 

測定原理

 

與氧化型細胞色素 C 不同,還原型細胞色素 C  550nm 有特征光吸收,因此 550nm 光吸收增加速率能夠反映線粒體復合體酶活性。

 

需自備的儀器和用品

 

可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑的組成和配制

 

試劑一:25mL×1 瓶,-20℃保存;

 

試劑二:5mL×1 瓶,-20℃保存;

 

試劑三:0.5 mL×1 支,-20℃保存;

 

試劑四:液體 20mL×1 瓶,4℃保存;

 

試劑五:粉劑×1 支,-20℃保存;

 

試劑六:液體 2.5mL×1 瓶,-20℃保存;

 

樣本的前處理:

 

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

 

1 準確稱取 0.1g 組織或收集 500 萬細菌或細胞,加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

 

2 將勻漿 600g4℃離心 5min

 

3 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g4℃離心 10min

 

4 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測定從線粒體泄漏的復合體(此步可選

 

做)。

 

5 步驟中的沉淀即為線粒體,加入 200uL 試劑二和 2uL 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10 秒,重復 30 次),用于復合體酶活性測定。

 

測定步驟:

 

1 分光光度計預熱 30min 以上,調節波長至 550nm,蒸餾水調零。

 

2 樣本測定

 

1)工作液的配制:臨用前把試劑五轉移到試劑四中混合溶解,置于 37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)孵育 5min;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。

 

2)在 1mL 玻璃比色皿中加入 40μL 樣本、100μL 試劑六和 800μL 工作液,立即混勻,記錄 550nm 處初始吸光值 A1  2min 后的吸光值 A2,計算 ΔA=A2-A1

 

復合體Ⅲ活力單位的計算:

 

1 按樣本蛋白濃度計算

 

單位的定義:每 mg 組織蛋白每分鐘催化產生 1 nmol 還原型細胞色素 C 定義為一個酶活力單位。

 

?   此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

 

2 按樣本鮮重計算

 

單位的定義:每 g 組織每分鐘催化產生 1nmol 還原型細胞色素 C 定義為一個酶活力單位。復合體活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷ ε×d ×109]÷(W× V ÷V 樣總)

 

÷T=124×ΔA÷W

 

3 按細菌或細胞密度計算

 

單位的定義:每 1 萬個細菌或細胞每分鐘催化產生 1nmol 還原型細胞色素 C 定義為一個酶活力單位。

 

復合體活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(500×V ÷V 樣總) ÷T=0.248×ΔA V 反總:反應體系總體積,9.4×10-4 Lε:細胞色素 C 摩爾消光系數,1.91×104 L / mol /cmd:比色皿光徑,1cmV 樣:加入樣本體積,0.04 mLV 樣總:加入提取液體積,0.202 mLT:反應時間,2 minCpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL W:樣本質量,g500:細胞或細菌總數,500 萬。

 

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