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谷胱甘肽還原酶(GR)說明書8

時間:2017/8/28閱讀:2128
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谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase, GR)說明書

 

分光光度法 50 /48

 

注意:正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定。

 

測定意義:

 

GR 是廣泛存在于真核和原核生物中的一種黃素蛋白氧化還原酶,是谷胱甘肽氧化還原循環的關鍵酶之一(通常昆蟲中 GR  TrxR 取代)。GR 催化 NADPH 還原 GSSG 生成 GSH,有助于維持體內 GSH/GSSG 比值。GR 在氧化脅迫反應中對活性氧清除起關鍵作用,此外 GR 還參與抗壞血酸-谷胱甘肽循環途徑。

 

測定原理:

 

GR 能催化 NADPH 還原 GSSG 再生 GSH,同時 NADPH 脫氫生成 NADP+NADPH  340 nm 有特征吸收峰,相反 NADP+在該波長無吸收峰;通過測定 340 nm 吸光度下降速率來測

 

定 NADPH 脫氫速率,從而計算 GR 活性。

 

自備儀器和用品:

 

紫外分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、移液器、1mL 石英比色皿和蒸餾水

 

試劑組成和配置:

 

試劑一:液體 100mL×1 瓶,4℃保存。

 

試劑二:粉劑×1 瓶,4℃保存。臨用前加入 5.0 mL 蒸餾水,混勻。

 

試劑三:液體 3mL×1 支,4℃保存。

 

粗酶液提取:

 

1. 組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL) 15~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 試劑一)進行冰浴勻漿。8000g4℃離心 15min,取上清,置冰上待測。

 

2. 細菌、真菌:按照細胞數量(104 個):提取液體積(mL)為 500~10001 的比例(建議 500 萬細胞加入 1mL 試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率 300w,超聲 3 秒,間隔 7 秒,總時間 3min);然后 8000g4℃,離心 15min,取上清置于冰上待測。

 

3. 血清等液體:直接測定。

 

操作步驟:

 

1. 分光光度計預熱 30 min,調節波長到 340 nm,蒸餾水調零。

 

2. 試劑一置于 25℃(普通物質)或者 37℃(哺乳動物)中預熱 30min

 

3. 測定管:取 1mL 石英比色皿,依次加入 50μL 試劑三,100μL 試劑二, 750μL 試劑一,

 

100μL 上清液迅速混勻, 340nm 測定 10 s  190 s 吸光度,記為 A  1  A  2A

 

測定管= A  1A  2(注意加完上清液后迅速混勻測定)

 

計算公式:

 

(1). 按蛋白濃度計算

 

活性單位定義:在一定溫度中,pH8.0 條件下,每毫克蛋白每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個酶活單位。

GR 酶活(nmol/min/mg prot)= [ A 測定管÷ε÷d×V 反總×109]÷[Cpr×V ]÷T

= 536×A 測定管÷Cpr

 

(2). 按樣本質量計算

 

活性單位定義:在一定溫度中,pH8.0 條件下,每克樣本每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為

 

個酶活單位。

 

GR 酶活(nmol/min/g 鮮重)= [ A 測定管÷ε÷d×V 反總×109] ÷(W×V ÷V 樣總)÷T = 536×A 測定管÷W

 

(3) 按細胞數量計算

活性單位定義:在一定溫度中,pH8.0 條件下,每 104 個細胞每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個酶活單位。

GR 酶活(nmol/min/104 cell)= [ A 測定管÷ε÷d×V 反總×109] ÷(細胞數量×V ÷V 樣總)÷T

 

536×A 測定管÷細胞數量

 

4)按液體體積計算

 

活性單位定義:在一定溫度中,pH8.0 條件下,每毫升液體每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個酶活單位。

GR 酶活(nmol/min/mL)= [ A 測定管÷ε÷d×V 反總×109]÷×V ÷T

= 536×A 測定管

 

εNADPH 摩爾消光系數 6.22×103L/mol/cmV 反總:反應體系總體積,1000μL=0.001 L

 

1061 mol=1×106μmol Cpr:上清液蛋白濃度(mg/mL);V 樣:加入反應體系中上清液體積,100μL =0.1 mLV 樣總:加入提取液體積,1mLW,樣本質量,gT:反應時間,

 

min

 

注意事項:

 

1)樣品處理等過程均需要在冰上進行,且須在當日測定酶活力,勻漿液避免反復凍融;(2)試劑二須現配現用,配制完后,置于冰上,未使用完的 4℃保存,三天內使用完。(3測定前須先用 12 個樣做預實驗,哺乳動物組織一般須用試劑一稀釋 25 倍。

 

4)細胞中 GR 活性測定時,細胞數目須在 300 -500 萬之間,細胞中 GR 的提取時可加試劑一后研磨或超聲波處理,不能用細胞裂解液處理細胞。

 

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