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青島捷世康生物科技有限公司
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線粒體復合體Ⅱ試劑盒說明書

時間:2016/10/24閱讀:1515
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線粒體復合體試劑盒說明書

 

分光光度法 25 管/24 樣

 

測定意義

線粒體復合體又稱琥珀酸-輔酶 Q 還原酶,廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞的線粒體中,催化琥珀酸氧化生成延胡索酸,同時輔基 FAD 還原為 FADH2,后者進一步還原氧化型輔酶 Q 生成還原型輔酶 Q,是呼吸電子傳遞鏈的支路。

測定原理

復合體的催化產物還原型輔酶 Q 可進一步還原 2,6-二氯吲哚酚,2,6-二氯吲哚酚在 605nm 有特征吸收峰,通過檢測 2,6-二氯吲哚酚的減少速率來計算該酶活性。

需自備的儀器和用品

可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制

試劑一:25mL×1 瓶,-20℃保存;

試劑二:5mL×1 瓶,-20℃保存;

試劑三:0.5 mL×1 支,-20℃保存;試劑四:液體 25mL×1 瓶,4℃保存;試劑五:粉劑×1 支,-20℃保存;試劑六:粉劑×1 支,-20℃保存;試劑七:液體 2.5mL×1 瓶,4℃保存;

樣本的前處理:

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

1、準確稱取 0.1g 組織或收集 500 萬細胞,加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、將勻漿 600g,4℃離心 5min。

3、棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11100g4℃離心 10min。

4、上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測定從線粒體泄漏的復合體(此步可選做)。

5、步驟中的沉淀即為線粒體,加入 200uL 試劑二和 2uL 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10 秒,重復 30 次),用于復合體酶活性測定。

測定步驟:

1、分光光度計預熱 30min 以上,調節波長至 605nm,蒸餾水調零。

2、樣本測定

1)工作液的配制:臨用前把試劑五和試劑六轉移到試劑四中混合溶解,置于 37℃(哺乳動物)或 25℃(其它物種)孵育 5min

2)在 1mL 玻璃比色皿中加入 40μL 樣本、100μL 試劑七和 800μL 工作液,立即混勻,記錄 605nm 處初始吸光值 A1 和 2min 后的吸光值 A2,計算ΔA=A1-A2。

復合體活力單位的計算

1) 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義:每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個酶活力單位。

復合體活力(U/mg prot)=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=559×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

2) 按樣本鮮重計算

單位的定義:每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個酶活力單位。

復合體活力(U/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=113×ΔA÷W

3) 按細菌或細胞密度計算

單位的定義:每1 萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個酶活力單位。復合體活力(U/104 cell)=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T =0.226×ΔA V 反總:反應體系總體積,9.4×10-4 L;ε2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數,2.1×104 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V 樣:加入樣本體積,0.04 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應時間,2 minCpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細胞或細菌總數,500 萬。

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