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引言

腫瘤發病率和死亡率持續增高造成了嚴重的社會負擔，驅動著腫瘤治療的重要手段之一的CAR-T，TCR-T等細胞治療技術的發展。
細胞治療是利用來自患者或供體的活細胞來代替受損或患病的細胞，或刺激身體的免疫反應或再生的治療，通常使用的是干細胞與免疫細胞。
本期將分別從基因、蛋白、細胞、組織四個層面展開，對細胞治療領域前沿技術與文獻進行解析和分享。

#1 基因層面

單細胞測序技術在細胞治療中的應用
01 干細胞治療
通過干細胞分離、體外培養、定向誘導、甚至基因修飾等過程，在體外繁育出全新的、正常的甚至更年輕的細胞、組織或器官，并最終通過細胞組織或器官的一致實現對臨床疾病的治療。
干細胞種類多，按發育潛能和階段可以分為不同類型。不同條件會誘導出不同類型、不同干性的干細胞；通過單細胞測序技術，分析細胞轉錄及蛋白特征，可以準確了解干細胞的表型，也可聯合臨床結果做關聯性分析。

· 樣本類型：健康人&AML（急性髓系白血病）患者骨髓
· 前期準備：流式富集，將CD34陽性造血干細胞、CD34陰性細胞、CD3陽性T細胞混樣測序
· 細胞分型：通過轉錄組+蛋白組學的研究，將骨髓內的干細胞分為了56個亞群

·Focus在CD34陽性的造血干細胞
進行以下分析：

1. 擬時序分析HSC發育狀態。

2.通過Abseq定義新的HSC發育Marker。

3.通過對HSC的Abseq結果進行算法分析，最終用12個Marker高精確度地鑒定14個CD34陽性亞群。

單細胞測序的優勢特點在于，通量更高，可達上萬個基因的維度分析。

02 CAR-T細胞治療
 CAR-T細胞治療工作流程

單細胞測序技術應用節點：
研發質控階段——分析T細胞發生了哪些變化，細胞狀態、克隆型、生物學特征、臨床關聯等。

（1）在CAR-T治療臨床前應用

（2）在CAR-T臨床研究中的應用

單細胞測序優勢：
在傳統技術上進行更加透徹的分析：大細胞通量的條件下，進行全基因組+蛋白組，高緯度地分析每一個單細胞特征，包括：基因表達、富集功能、特異性Marker、聚類分群、異質性等。

03 TIL、TCR治療
（1）TIL治療機制研究

通過單細胞RNA測序發現，聯合過繼性療法IL8R1+cluster細胞比例更高：IL8R1+cluster中高表達IL7R。

（2）腫瘤特異性TCR研究

（間接研究antigen-TCR）

發現黑色素瘤抗原特異性CD4+T亞群，并研究其phenotype及功能。

（直接研究antigen-TCR）
抗原特異性CD8+T細胞表型分析
CD8+T細胞：抗原-TCR paire分析

全基因組光學圖譜技術（OMG）在細胞治療中的應用
01 文獻解析
AML和MDS患者中，DEK-NUP214融合是重現性的異常，預后不良。該融合在髓系血液腫瘤中比例較低（~0.7-2%）.傳統核型G顯帶不容易檢出t(6;9),尤其是低分辨率的骨髓染色體。加拿大大學健康醫學聯盟在今年2月報道了AML患者中t(6;14;9)三重易位，據了解，這是first通過細胞遺傳學檢出的AML患者中t(6;14;9)三重易位。

t(6;9)的其他易位形式報道案例較少，2例涉及DEK-NUP214融合事件被報道。一例是核型檢出t（1;9）, 轉錄組檢出DEK-NUP214融合。另一例是細胞遺傳學檢出t(9;12)(q34;q15)且隱匿性插入在6號染色體上，也是通過RNA seq檢出DEK-NUP214融合。由于6p和9q遠端片段交換或隱匿性插入較難觀察到，導致難以確定是否存在DEK-NUP214融合。將高分辨率SV檢測技術OGM納入常規臨床檢測有助于檢出罕見的隱匿性的細胞遺傳學異常。

該患者為一位32歲男性，圖（A）核型G顯帶初始檢測結果為18個細胞add(6)(p21),add(9)(q34),add(14)(q22)，2個細胞核型正常。基于核型結果6號和9號染色體易位斷裂點位于DEK和NUP214基因所在的區帶，序貫進行DEK和NUP214的FISH探針檢測，圖（B）顯示在衍生6號染色體上觀察到DEK和NUP214融合信號，隨后依據FISH驗證結果將核型結果修正為t(6;14;9)(p22;q22;q34).

隨后進行了OGM檢測，circos plot圈圖（C）顯示斷裂點該患者樣本檢出位于6p22.3,9q34.12,14q22.1的三重易位，且線形圖（D）顯示DEK-NUP214融合基因。DEK-NUP214融合基因預后不良，該患者經誘導治療，鞏固治療后接受了同種異基因造血干細胞移植。

OGM可一次實驗檢出和明確涉及DEK-NUP214融合的t(6;14;9)三重易位，該團隊建議將OGM納入臨床實驗室常規檢測流程，用于檢出白血病中與預后和治療相關的異常。

  · Bionano Saphyr系統以100kbp-Mbp級別讀長可實現超高靈敏度的結構變異檢測分析和復雜基因組de novo組裝。

在結構變異檢測領域目前廣泛應用于腫瘤、白血病、遺傳病、罕見病等疾病的研究。相比傳統的結構變異檢測工具，如核型、FISH，Saphyr 擁有優秀的分辨率、全基因組覆蓋度，便捷的操作流程以及直觀的結果呈現，對結構變異領域的難點平衡易位和倒位，可準確檢出。在基因組de novo組裝領域，Saphyr 幫助生物學家極大提高scaffold，提升組裝質量和完整性。

Saphyr 半導體芯片上有多達120,000個納米通道，經高清CCD對所有納米通道的DNA實時成像，每個flowcell可采集高達5T數據，軟件自動將圖片數據轉換成分子數據，最終組裝得到全基因組光學圖譜。

#2 蛋白層面

MSD第三代電化學發光分析技術在細胞治療中的應用
01 應用總覽

  · 在接受CAR-T細胞治療前，評估病人免疫狀況，（Cytokinesis，CRP，Inflammation）。
  · 評估細胞因子狀況，是否被激活，有效性（IFN-γ）。
  · 監測免疫系統的狀態
  · 監控免疫進程，免疫有效性，副反應發生，評估免疫原性，毒性。

免疫治療相關熱門靶點：CTLA-4,Granzyme A,Granzyme B,LAG3,vWF，PD1，PDL-2，推薦使用MSD R-plex試劑盒進行開發驗證實驗，目前可以提供超過260種抗體對可供選擇，應用涵蓋：癌癥、免疫、心血管、神經、代謝、疫苗等。
     
02 應用案例
(1)同濟醫院采用MSD進行CAR-T細胞治療臨床效果的關聯性分析

IL-8，IL1β，IFN-γ升高，代表患者感染，需采取不同的治療方案

結論：使用CAR-T細胞治療后，若患者發熱，則可通過分析以上因子的分泌情況，區分患者感染與CRS

（2）Kite 制藥，使用MSD監測CRS

發現使用MSD技術相較于Luminex更加簡便，且有嚴格的Validation。

（3）紀念斯隆-凱特琳癌癥中心

（4）eurofins歐陸集團

(5)中檢院
《CAR-T細胞治療產品質控研究要點》建議采用MSD方法進行藥效學檢測、免疫毒性檢測。

（6）諾華制藥：
上市的細胞治療藥物免疫原性評價時，使用MSD進行檢測
 
（7）Juno在細胞治療研發階段使用到MSD
采用基因編輯的方法，敲除PD1，進行免疫水平評估，探究是否能夠提高CAR-T細胞治療效果。結果表明：CAR-T細胞免疫原性明顯增強。
 
  (8)使用CAR-T成功治愈患者的學者Carl H.June，以及腫瘤免疫治療先*Steven A Rosenberg也采用MSD方法進行細胞免疫學研究。

03 MSD在CRS（細胞因子風暴）監測應用的優勢特點
 CRS監測需借助靈敏度高、動態范圍廣、有嚴格法規驗證的平臺。這凸顯了MSD技術的極大優勢：

（1）4-5 log超寬檢測范圍，fg/ml的檢測極限，多個產品類型選擇

（2）經過嚴格的Validation的V-plex試劑盒

  · CRS監測應用案例
Kite ，NCI，Juno等使用MSD試劑盒監測CAR-T細胞治療的細胞因子風暴

  · 免疫原性金標準
獲FDA，EMEA等法規推薦，經過大量臨床實驗使用和CRO驗證，符合GLP要求。

MSD技術流程概覽

#3 細胞層面

Lonza核電轉儀在細胞治療中的應用

自體T細胞免疫療法其中一個關鍵痛點是GMP病毒載體（慢病毒和γ-逆轉錄病毒）的安全性、漫長的生產周期和高額的費用。

 解決這個問題的一個辦法是利用非病毒轉染方法對細胞進行基因修飾。該研究和開發進展迅速，但關鍵瓶頸在于擴大制造規模以滿足商業需求。

Lonza的4D-Nucleofector™LV 單元采用電穿孔技術，可實現自動化、可擴展多種細胞類型和應用的非病毒轉染方案。

以新鮮/冷凍的PBMC作為起始，4D-Nucleofector ™轉染后，轉入平臺，第10天收獲最終的T細胞產物。

如圖所示，在電轉后：

第0天-完成電轉的PBMC靜置4小時恢復，用含有IL-2和TransAct的X-VIVO培養基進行80%換液。
第1天–進行50%的培養基交換（276ml容量）。
第3天–進行80%的培養基交換（450ml容量），并移除TransAct。
第4天到第9天-進行75%的培養基交換（450ml容量）。
第10天-收集擴增的T細胞。

在第0、1、4、7和10天取樣分析。

#4 組織層面

HALO數字病理圖像全景分析技術在細胞治療中的應用

腫瘤微環境中免疫細胞的特征及其對腫瘤治療和預后的潛在影響是近年來研究的熱點。在組織空間程度上分辨基因表達已成為了解組織內復雜多細胞相互作用的關鍵技術。RNA和蛋白質的分析為理解表達調控提供了寶貴的信息，能夠在空間的角度對蛋白質和基因的表達水平進行分析。為了探索組織內細胞復雜的相互作用，ISH-IHC的相互結合為在同一組織樣本上觀察多個RNA和蛋白質的表達提供了可能。

通過策略性地選擇ISH和IHC/IF標記，RNAscope可以針對分泌蛋白(如細胞因子或趨化因子)的轉錄本，而IHC/IF可以針對細胞標記，以識別分泌蛋白的細胞來源。

免疫細胞浸潤到腫瘤，其激活狀態和檢查點表達模式均可通過雙重ISH-IHC/IF法進行檢測，其中ISH檢測激活標志物，IHC/IF法檢測CD3、CD4、CD8、CD68、CD45等免疫細胞標志物。

此外，用戶還可以根據IF和探針的陽性率來定義細胞表型。

KFBIO江豐數字化病理掃描儀

01 設備推薦
  · 高通量持續加載掃描系統KF-PRO-400

  · 明場&熒光一體掃描系統KF-PRO-EX

02 產品特點
  · 高速掃描——線掃描技術
  · 高速穩定運動——直線磁軸電機
  · 自適應的掃描方式
  · 熒光機型——KF-FL系列（科研級SCMOS熒光相機）
  · 專業分析軟件