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上海慧穎生物科技有限公司

SH30070.03

時間:2016-4-27閱讀:1733

TUNEL細胞凋亡檢測 (TUNEL Apoptosis Assay)是一種高靈敏度又快速簡便的細胞凋亡檢測方法。對于待檢測的細胞或組織樣品,經(jīng)過生物素標記和后續(xù)的DAB顯色等步驟,即可在普通光學(xué)顯微鏡下觀察到凋亡細胞。

細胞在發(fā)生凋亡時,會激活一些DNA內(nèi)切酶,這些內(nèi)切酶會切斷核小體間的基因組DNA。細胞凋亡時抽提DNA進行電泳檢測,可以發(fā)現(xiàn)180-200bp的DNA ladder。

基因組DNA斷裂時,暴露的3'-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上生物素(Biotin)標記的dUTP(Biotin-dUTP),隨后和辣根過氧化物酶(HRP)標記的Streptavidin (Streptavidin-HRP)結(jié)合,zui后在HRP的催化下通過DAB顯色來顯示凋亡細胞,從而可以通過普通光學(xué)顯微鏡檢測到凋亡的細胞。

技術(shù)步驟

1. 材料與試劑 (以Promega試劑盒為例),包括:

(1)生物素標記的-dUTP(Biotin-dUTP)或地高辛標記的-dUTP(Digoxingeningll-dUTP) 1 nmol/µL

(2)TdT酶(25U/μL)

(3)反應(yīng)緩沖液

(4)洗滌緩沖液

(5)異硫氰酸熒光素(FITC)標記的親合素或鏈霉親合素(2.5µg/mL)或抗地高辛抗體(1︰30)

(6)PI染液(含PI 5µg/mL及無DNA酶活性的RNA酶0.1%)

(7)PBS緩沖液

(8)塑料蓋玻片

2. 樣品

(1)懸浮生長培養(yǎng)細胞的甩片或涂片

(2)貼壁生長的培養(yǎng)細胞

(3)冰凍切片

(4)常規(guī)石蠟切片

3. 操作方法

(1)固定:培養(yǎng)細胞的制片或冰凍切片用4%多聚甲醛固定30min(4℃)后,用80%酒精再固定2h(-20℃)。常規(guī)4%中性福爾馬林固定、石蠟包埋之切片進行脫蠟、水化。

(2)洗滌:玻片浸入PBS緩沖液,搖床上洗滌5min,三次。

(3)反應(yīng):洗滌后的玻片用吸水紙吸干細胞或組織周圍水分,按50μl/cm2滴加反應(yīng)液(每50μL反應(yīng)液含TdT酶0.5μL,標記的-dUTP 1μL),使反應(yīng)液均勻地覆蓋于所有細胞或組織切片上,蓋上塑料蓋玻片,置濕盒中,37℃孵育1h。

(4)終止反應(yīng):去掉塑料蓋玻片,將玻片置盛有洗滌緩沖液的染色缸內(nèi),洗滌兩次,每次5min。

(5)FITC標記:洗滌后的玻片用吸水紙吸去細胞或組織周圍水分,按50μl/cm2滴加FITC反應(yīng)液(含F(xiàn)ITC 2.5μg/mL),室溫下避光孵育10min。

(6)洗滌:將玻片置于洗滌緩沖液內(nèi),洗兩次,每次5min。

(7)PI復(fù)染:將玻片置于盛有PI染液的染色缸內(nèi),室溫下避光染色30min。

(8)封片:用蓋玻片直接蓋在含PI染液的玻片上,亦可用無色指甲油涂于蓋玻片四周邊緣,置暗盒中,盡早鏡檢觀察。

4. 結(jié)果判定:用熒光顯微鏡觀察,選用藍色激發(fā)光(波長488nm),所有的細胞核均被PI著色,顯示出紅色熒光,而凋亡細胞被特異地標記上FITC,顯示出黃綠色熒光。

應(yīng)用領(lǐng)域

細胞凋亡(apoptosis)的分析方法,細胞凋亡有一項重要的特征為細胞內(nèi)的DNA會碎裂成片段(DNA fragmentation),TUNEL可以有效的去探測DNA片段的產(chǎn)生。

服務(wù)周期

交貨時間: 15~20天

客戶須知(對材料的要求、注意事項)

結(jié)果提供: 正常和陽性對照玻片及其1張數(shù)碼照片,剩余石蠟塊,檢測報告;

樣本要求:取材保持組織新鮮(組織塊以小于2cm×1.5cm×0.3cm為宜),立即放入固定液(固定液用10%福爾馬林液或4%多聚甲醛緩沖液,體積為組織塊的10倍以上)中,避免干燥;對于有血跡的樣本,可用PBS液或生理鹽水沖洗后直接放入固定液中;經(jīng)固定后的樣本必須在48小時內(nèi)處理。

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