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elisa細胞裂解液獲取方法

時間:2013-12-11閱讀:5162

 elisa細胞裂解液獲取方法

細胞裂解是改變細胞通透性和活性的重要實驗方法。通常我們都會想到用RIPA裂解液提取的蛋白做elisa,但是這個方法不太推薦,從提取蛋白自身的角度來考慮,RIPA裂解液可以使蛋白質的空間結構破壞,即破壞蛋白質分子的二級和三級結構,從而使抗原決定簇得以充分暴露在外,更有利于被檢測出來;而從試劑盒本身的角度來考慮,以雙抗體夾心法為例,提取的蛋白中含有RIPA裂解液,當加入到包被的孔板當中時,可能同樣會對孔板中的包被的抗體起到了裂解作用(如SDS),從而使其失去該有的特異性,這方面可能需要考慮在內的。

下面我們推薦另外2種比較好的獲取細胞裂解液中蛋白的方法:

1、         凍溶法,是一種常用的機械裂解方式比,通常由冷凍和解凍兩部分組成(freezing and thawing),。原理:由于細胞內冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹,使細胞結構破碎。冷凍通常在液氮或-20°C冰上進行,解凍可以在37、50、65 100℃水浴中進熱休克比化學裂解溫和,但是很有效,有資料表明用熱休克和溶菌酶與SDS的方法獲得了90%的細胞裂解率。如果需求的蛋白表達很低,我們可以用細胞裂解液作輔助,方法是先用裂解液室溫裂解一小時,然后反復凍溶三次。一般可以裂解到8ug/ul切記裂解細胞時不要加太多裂解液,而且避免過多的反復凍溶。

2、         超聲波處理(Ultrasonication)既利用超聲加熱的方法,把細胞破碎。但這種處理會導致DNA 的斷裂,所以加熱不宜過劇烈,要設定好超聲時間和間隙時間,一般超聲時間不超過5秒,間隙時間大于超聲時間,這些都有利于保護酶的活性。bead-beating 也是常用的機械處理方式,有報道指出bead-beating 比熱休克和化學裂解的細胞裂解效果更好 雖然DNA產量較高,但通常得到的dna片段較小。

3、         Western Blot方法,方法步驟主要以下:

1)一瓶細胞(100ml的瓶子,PBS2次,胰酶消化,加入10ml 培養液,制備成細胞懸液;

2)細胞懸液移入10ml離心管中,4。C2500rpm,離心5min

3)上清,加入預冷的PBS(4C存放的PBS)于離心管中,吹打,4C,2500rpm,離心5min;棄上清,重復上述步驟一次;共洗細胞2次,充分洗掉培養液;

4)上清,加入200ul細胞裂解液1ml裂解液中加入10ulPMSF),置于冰上,裂解40min1h;裂解過程中可用槍頭吹打或間斷搖動離心管,以使蛋白充分裂解;

5)出離心管,于4。C,12000rpm,離心5min

6)上清移入EP管中,-20C保存,即可。

細胞裂解機制被廣泛應用于各類的生物實驗中。為達到*的實驗結果,需要注意的是所有的實驗步驟都需在四度以下進行,并且避免過多的反復凍融。而且整個實驗過程中記得戴手套。

綜述來源:慧穎生物免疫實驗室

:王

以上所述僅供參考,希望大家指教。

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