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自己做過一些簡并引物，現將我利用生物信息學資源設計簡并引物的各個步驟作一個總結，各位戰友可將各自的心得體會寫下，以便大家交流！！！
一、利用ncbi搜索不同物種中同一目的基因的蛋白或cDNA編碼的氨基酸序列
因為密碼子的關系，不同的核酸序列可能表達的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez檢索系統，查找到一條相關序列即可。隨后利用這一序列使用BLASTp（通過蛋白查蛋白），在整個Nr數據庫中中查找與之相似的氨基酸序列。
二、對所找到的序列進行多序列比對
將搜索到的同一基因的不同氨基酸序列進行多序列比對，可選工具有Clustal W，也可在線分析[url][/url]http://www.ebi.ac.uk/clustalw/ 。其結果入下圖所示,所有序列的共有部分將會顯示出來。“*”表示保守，“：”表示次保守。
一、利用ncbi搜索不同物種中同一目的基因的蛋白或cDNA編碼的氨基酸序列
因為密碼子的關系，不同的核酸序列可能表達的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez檢索系統，查找到一條相關序列即可。隨后利用這一序列使用BLASTp（通過蛋白查蛋白），在整個Nr數據庫中中查找與之相似的氨基酸序列。
二、對所找到的序列進行多序列比對
將搜索到的同一基因的不同氨基酸序列進行多序列比對，可選工具有Clustal W，也可在線分析[url][/url]http://www.ebi.ac.uk/clustalw/ 。其結果入下圖所示,所有序列的共有部分將會顯示出來。“*”表示保守，“：”表示次保守。
三、確定合適的保守區域
設計簡并引物至少需要上下游各有一個保守區域，且兩個保守區域相距50～ 400個aa為宜，使得pcr產物在150~1200bp之間，zui重要的是每一個保守區域至少有6個aa殘基，因為每條引物至少18bp左右。若比對結果保守性不是很強很可能找不到6個aa的保守區域，這時可以根據物種的親緣關系，選擇親緣相近的物種進行二次比對，若保守性仍達不到要求，則需進行三次比對。總之，究竟要選多少序列來比對，要根據前一次比對的結果反復調整。zui終目的就是有兩個6個aa且兩者間距離合適的保守區域。
設計簡并引物至少需要上下游各有一個保守區域，且兩個保守區域相距50～ 400個aa為宜，使得pcr產物在150~1200bp之間，zui重要的是每一個保守區域至少有6個aa殘基，因為每條引物至少18bp左右。若比對結果保守性不是很強很可能找不到6個aa的保守區域，這時可以根據物種的親緣關系，選擇親緣相近的物種進行二次比對，若保守性仍達不到要求，則需進行三次比對。總之，究竟要選多少序列來比對，要根據前一次比對的結果反復調整。zui終目的就是有兩個6個aa且兩者間距離合適的保守區域。
四、利用軟件設計引物
當得到保守區域后，就可以利用專業的軟件來設計引物了，其中pp5支持簡并引物的設計（關于其的使用請見筆者的另一個帖子http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=8798113&sty=1），將參與多序列比對的序列中的任一條導入pp5中，再將其翻譯成核苷酸序列，有密碼子簡并性，其結果是有n多條彼此只相差以個核苷酸的序列群，該群可用一條有簡并性的核苷酸鏈來表示（其中R＝A／G，Y＝C／T，M＝A／C，K＝G／T，S＝C／G，W＝ A／T，H＝ A／C／T，B＝ C／G／T，V＝A／C／G， D＝A/G /T,N=A／C／G/T），該具有簡并性的核苷酸鏈必然包含上一步中找到的氨基酸保守區域的對應部分，在pp5中修改參數，令其在兩個距離合適的保守的nt區域內尋找引物對，總之要保證上下游引物都落在該簡并鏈的保守區域內，結果會有數對，分數越高越好。
當得到保守區域后，就可以利用專業的軟件來設計引物了，其中pp5支持簡并引物的設計（關于其的使用請見筆者的另一個帖子http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=8798113&sty=1），將參與多序列比對的序列中的任一條導入pp5中，再將其翻譯成核苷酸序列，有密碼子簡并性，其結果是有n多條彼此只相差以個核苷酸的序列群，該群可用一條有簡并性的核苷酸鏈來表示（其中R＝A／G，Y＝C／T，M＝A／C，K＝G／T，S＝C／G，W＝ A／T，H＝ A／C／T，B＝ C／G／T，V＝A／C／G， D＝A/G /T,N=A／C／G/T），該具有簡并性的核苷酸鏈必然包含上一步中找到的氨基酸保守區域的對應部分，在pp5中修改參數，令其在兩個距離合適的保守的nt區域內尋找引物對，總之要保證上下游引物都落在該簡并鏈的保守區域內，結果會有數對，分數越高越好。
五、對引物的修飾
若得到的引物為：
5-NAGSGNGCDTTANCABK-3
則其簡并度＝4×2×4×3×4×3×2=2304，很明顯該條引物的簡并度多高不利于pcr。我們可以通過用次黃嘌呤代替N（因為次黃嘌呤能很好的和4種堿基配對）和根據物種密碼子偏好這兩種方法來降低簡并度（有個查密碼子偏好的數據庫我以前發過大家搜索一下把）。
zui后，這樣子設計出來簡并引物對，適用于用于比對的氨基酸序列所屬物種及與這些物種分類地位相同的其他物種。
若得到的引物為：
5-NAGSGNGCDTTANCABK-3
則其簡并度＝4×2×4×3×4×3×2=2304，很明顯該條引物的簡并度多高不利于pcr。我們可以通過用次黃嘌呤代替N（因為次黃嘌呤能很好的和4種堿基配對）和根據物種密碼子偏好這兩種方法來降低簡并度（有個查密碼子偏好的數據庫我以前發過大家搜索一下把）。
zui后，這樣子設計出來簡并引物對，適用于用于比對的氨基酸序列所屬物種及與這些物種分類地位相同的其他物種。
