酶聯免疫測定（ELISA）標準化的一般原則

    對酶聯免疫測定標準化的目的就是通過這種標準化以改善實驗室測定的準確度，從而提高不同的實驗室間結果的可比性。進行標準化的先決條件是，標準品和檢測物應該是相同的，否則標準化就無從談起。這在目前的許多臨床免疫測定項目中標準品往往沒有達到這一要求。

    涉及到免疫測定標準化的組織有世界衛生組織（WHO）生物學標準化專家委員會（ECBS），其負責建立生物物質的標準及參比材料。WHO通過國家生物學標準和質控物研究所（NIBSC）提供大多數多肽激素和一些腫瘤標志物的標準品。一些區域和地區性組織也制備標準品，如美國的疾病控制中心（CDC）、美國病理學家協會（CAP）的國家委員會。國家衛生研究所（NIH）提供尤其是用于研究目的的多肽激素標準品。IFCC也已組織制備了一種脂蛋白和血清蛋白的標準品，可通過CAP得到。癌發生生物學和醫學學會已啟動一個腫瘤標志物的決定計劃。在國內中國藥品生物制品檢定所提供一些多肽激素、腫瘤標志物等標準品。衛生部臨床檢驗中心則為全國各級醫院血站實驗室提供室內質控物。盡管僅僅使用標準品并不能保證免疫測定結果的可比性，但標準品對保證免疫測定的重要性是不言而喻的。目前在世界上有各種不同的科學協會如IFCC及國家臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）以及美國和加拿大臨床化學協會（AACC和CSCC）等正致力于免疫測定的標準化工作，這些組織也制備一些標準品。在美國，免疫測定必須有食品和藥物管理局（FDA）的批準。在德國的監督機構是醫學實驗室標準化和文件化研究所（INSTAND）。在國內免疫診斷試劑的審批由國家*（SDA）負責。衛生部臨床檢驗中心也正在著手臨床免疫檢驗標準化方面的工作。

    *代生物學標準品是在70多年前由Henry Dale制備的用于胰島素測定的標準品，該標準品被WHO的前身即國家衛生組織聯合會（League Of National Health Organization）所采用。從那時起，在一系列標準品（IS）中胰島素制劑的含量以單位（IU）表示，每一個標準品均用前一個進行校準。其后，對大多數重要的多肽激素和其他具有“復雜分子組成的物質”（即不能僅通過使用物理和化學方法*鑒定其均一性、效力或安全性的物質）均制備了標準品。每一種IS的單位由ECBS在合作研究的基礎上確定。并評估提出來作為一種IS的制劑在不同的試驗系統中的適用性。生物試驗主要是用于多肽激素標準的評價和使用以前的舊標準晶對新標準品的校準。因此，單位通常表示生物活性，但其也用于缺乏已知生物活性的物質。通常標準品的制備批量應至少夠用10—20年。

    對于臨床分析測定來說，標準品和參考制劑可用作校準物，而在每個具體的實驗室中，其可用來評價試驗的有效性，以及作為室內質控樣本，對測定的質量評價來說，也是非常有價值的。術語“IS”取代了已被WHO用于某些標準品的術語“參考制劑”（IRP）。目前使用的人絨毛膜促性腺激素（hCG）剛開始被稱為*代IRP，后來被稱為第三代IS。盡管大多數IS制劑由溶解在含一載體蛋白的緩沖液中的純抗原所組成，但某些標準品（如血清蛋白）是以血清作為基質材料的。標準品可歸類為*、第二和第三等三個等級。一級標準品數量有限，可使用10～20年，為凍干品，內含載體蛋白。一級標準可用來校準第二和第三級標準，例如，常規測定中使用的校準品。IS可作為*級標準品，一旦*級標準確定，二級標準可用來維持校準。校準的二級標準可在以國家為基礎的范圍內供應。標準品的特性應該清楚明確，理想的標準品應該是純的但仍需有特定分析物質可能的同種型不均一性，這種要求通常難以達到，因為在純化過程中，使用生化方法去除雜質會引起少量的同種型丟失。免疫親和層析純化方法可用來提取所有特異的同種型，但洗提過程常需在低pH變性條件下進行，這種變性條件可能會引起某些蛋白的不可逆修飾。免疫親和層析純化方法也可使用在細胞系統中表達生成的蛋白，但表達產物仍需純化和糖基化，而糖基化又可能與天然蛋白有所不同。

    目前可得到的標準品中特定分析物的濃度一般以U／L表示，而已經很明確的物質如類固醇和甲狀腺激素，則應以物質濃度（m01／L）表示。但已很明確的肽類激素的數量也正在不斷增加，因此，雖然促腎上腺皮質激素（ACTH）和胰島素已有標準品，但其濃度常以m01／L或g／L而不是U／L來表示。鑒定明確的腫瘤標志物的濃度常以質量濃度（g／L）表示，而不太明確的標志物則以的單位（U／L）表示。激素濃度以U／L表示會給人這樣一個印象，即所測定的是具有生物學活性的激素的濃度，但免疫測定并不能測定生物活性，其實際上測定的是抗原上一個決定基（epitope）或一組決定基的摩爾濃度，尤其是使用單克隆抗體進行測定時。因此，質量濃度（以m01／L表示）zui能確切地反映所測定的是什么。即使蛋白的糖的組成和等電點不均一，氨基酸分析也可準確地測定純化蛋白的含量。糖蛋白質量的稱重測定是不準確的，因為其含有結合很緊的水，凍干并不能去除。第四代hCG標準品將通過氨基酸分析的方法來測定，以m01／L來表示，至于將現有的第三代標準轉換至第四代的轉換因子可通過免疫測定進行交叉校準確定。如果一個免疫試驗測定分子量不同但免疫反應性相同的同一物質的不同分子變異體，則質量濃度可正確地反映不同成分的濃度，然而，如果不同的分子形式沒有相等的免疫反應性，則質量濃度也會出現偏差，該問題可通過使用具有適當特異性的抗體和標準品來解決。

    當標準晶更換時也會出現標準化方面的問題，一個新的標準品可能會改變診斷免疫試驗的效果估價，盡管已進行了仔細的校準。使用生物試驗校準激素標準品頗為復雜，生物試驗較之免疫試驗的重復性要差，對免疫反應性影響不大的激素的糖組成成分對其生物活性卻影響較大，用于體內和體外實驗的效果是不一樣的。如果一新的激素標準品是根據生物活性來進行校準的，則將其用于免疫測定時會有所不同。如卵泡刺激激素標準FSH83／575用于FSH免疫測定校準時，其變化因子為4，但催乳激素、促黃體生成激素（LH）和生長激素則不引起或只引起很小的改變。

    從一級標準的值傳遞到zui終試驗所使用的校準物的過程通常由幾個校準步驟組成，包括標準品和測定方法、緩沖液及其基質、稀釋的控制、zui終結果的統計學評價和質量控制等。當建立一個測定方法時，一級標準品的值要傳遞至二級、三級和（或）校準品，使得所建立的方法的測定值可溯源至一級標準品。當引入一批新的試劑時，即需要重復這種傳遞過程，從而保持校準的可靠性。不同的分析物如血清蛋白、多肽激素或與載體蛋白結合的低分子量激素等其校準過程有所不同。

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