ELISA的基本原理-固相上抗原抗體相互作用的免疫化學

一、ELISA的基本原理

    酶聯免疫吸附試驗（ELISA）顧名思義就是以酶作為標記指示物、以抗原抗體免疫反應為

基礎的固相吸附測定方法。因此，一個ELISA測定試劑，其有機組成部分包括三個方面，即固相支持物及包被的抗原或抗體、酶標記的抗體或抗原和酶反應底物等。抗原或抗體的固相化并不影響其免疫結合活性，酶標記的抗體或抗原亦是如此，并且標記酶的活性不因標記過程而喪失。整個測定中，抗原抗體結合反應在固相支持物上進行，反應結果的判斷以酶與其底物作用后的顯色或產生熒光或發光反應為準則，顯色或產生熒光或發光的強度與臨床標本中待測物的濃度成正比或反比關系。目前國內的ELISA試劑盒均以酶的顯色反應來完成測定。

二、固相上抗原抗體相互作用的免疫化學

    通常所提到的抗原抗體的相互作用，一般指的是在液相狀態下，那么在固相狀態下，抗原抗體的結合反應有什么樣的特點呢?本處作一簡單介紹。

    1．固相上抗原抗體結合反應所需要的時間  通常，固相免疫測定如ELISA中抗原抗體結合達到平衡所需要的時間，要大于液相免疫測定，并隨液體所占體積與界面抗體或抗原受體所占體積比的增加而增加。當在微孑L板孔內進行免疫測定時，界面反應動力學顯示其對擴散作用有很強的依賴性，擴散性越強則反應所需時間越短，結合越充分。這一點可通過旋轉振蕩來達到，微孔的旋轉振蕩可促使液體進入到可與抗體或抗原包被界面接觸的較小的區域內。也可在微孔中放一個惰性的塞子以使反應液體成為一個小體積，或使用一個具有大表面的多孔的基質如硝酸纖維素，或使用微顆粒來做到這一點。微顆粒小于lum時，在測定時即成膠體懸液，而當顆粒或珠較大時，則會在沒有振蕩時，由于重力的作用而分開。所有上述方法均是通過減少液體所占體積與界面抗體或抗原受體所占體積比，從而減少固相免疫測定的擴散依賴性。

    2．反應體積  此處的反應體積并非是微孔中的液體體積，而是固相免疫測定中與固相包被的抗體或抗原有接觸的部分，這部分體積到底有多少，很難測定，但比反應管中總液體體積要少得多。固相抗原抗體反應發生于液體—固相界面，可能處于一級結合鍵的引力距離內，小于10nm。液相中待測抗原或抗體要進入到這個結合界面，需要擴散或質量轉移。微顆粒的反應表面區域較微孑L要大得多，因而處于抗原抗體結合界面的體積占總反應體積的比例亦高得多。因此，結合反應的效率更高。這也是全自動化免疫測定分析儀均采用微顆粒固相的重要原因之一。可參與結合反應的抗體或抗原的濃度取決于可參與結合的反應體積，這無法計算。這一點使得使用通常的質量作用定律圖形的Keq的計算變得復雜化，因此，固相抗原抗體反應的KeQ值與液相抗原抗體反應的Keq值沒有可比性。

    3．離解速率  界面包括細胞表面上的結合反應的離解速率較液相中的要低兩個梯度，固相免疫測定中的緩慢的離解速率與細胞表面上發生的緩慢的離解速率的相似性很有意思，其原因如下：首先，細胞表面上的許多的相互作用涉及到細胞表面受體的聚集，由于多價復合物離解的減少，相應地親和力增加。研究表明，被動吸附于固相的抗原和抗體顯然也是成簇或聚集狀的，因此，反應界面的抗原或抗體可能也是“成簇的”。其次，大多數抗原—抗體的離解所需的能量比防止其結合所需的能量要大，表明在初始結合鍵形成后，又形成了次級結合鍵。這提示在固相免疫測定和其他細胞表面反應中，形成了大量的次級結合鍵。第三，很高的固相抗體或抗原濃度，尤其是以成簇出現的以及來自于限定的界面反應體積的抗體或抗原，使得離解的抗原的重新結合較液相系統更為快速。這可以解釋為何固相免疫測定與液相測定相比時，其抗體的Keq較高。正是這種極緩慢的離解速率，使得ELISA和固相免疫測定技術具有很好的適用性，即使是測定的反復洗滌步驟，也不影響受體配體的相互作用，使之保持結合狀態。

    4．微孔內特異抗體的免疫測定  使用吸附的復雜抗原進行微孔內特異抗體的免疫測定，

與液相測定相比，有明顯的親和力依賴性，固相受體—配體相互作用的穩定性似乎與微孔內特異抗體的免疫測定親和力依賴性和極低比例的所捕獲的總抗體相矛盾，這可能是因為：

    （1）有結合能力的抗原濃度極低。這可能是由于所吸附的抗原因為變性或空間位阻而致

抗原表位喪失的結果。

    （2）抗原表位由于吸附發生改變，使得被其抗體結合部位以較低的親和力結合。當抗原以l一5ug／m1濃度被動吸附于固相時，大多數蛋白抗原的60%～80％至少會以一個單層而穩定的吸附于固相，這樣在固相上的總的抗原就不會缺乏。如果500～800ng抗原穩定的吸附于微孔板孔，對含500／~g／ml抗體的血清的1：10 000稀釋可提供大于10倍過量的抗原，考慮到相互作用的合理的Keq，吸附抗原的有限性不能解釋這個結果。因此，由于空間位阻或吸附引起的變性所致的抗原表位的喪失，似乎更有可能。

    5．固相的抗體或抗原  固相化的抗體或抗原可能與液相中的抗體或抗原所展示的構型不一樣，對抗體或抗原由于固相化尤其是被動吸附或其他吸附方式所致的構型改變已有充分的認識。

廈門慧嘉生物科技有限公司專業提供各品牌ELISA試劑盒
詳情請登入: http://www.biohj.com
http://www.biohj.com/product.aspx?cid=1 

查詢，或    ：sale@biohj.com