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如何正確選擇透析袋

時間:2014/7/29閱讀:2271
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 背景:

spectrumlabs提供低蛋白結合的生物技術級纖維素酯(CE) 透析膜管和Float-A-Lyzer® G2即用型透析裝置,包括100-1,000,000道爾頓的9種截留分子量規格。膜截留分子量是指截留90%樣品時的膜孔徑大小,在蛋白純化應用中,選擇zui適截留分子量的透析膜是去除不需要的小分子污染物所必須的。


由于在脫鹽、 pH值調整及緩沖液置換等應用中,離子物質通常小于膜孔徑,且至少比大分子物質小1000倍,所以選擇截留分子量在3.5 kD至100kD 之間的膜即可在1-2天內達到所需的分離效果。*需要考慮的是,所選的膜截留分子量應小于需要截留的大分子物質的分子量。


透析是對不穩定的蛋白、敏感的酶以及精細化合物進行溫和分離的方法,以維持物質的活性、功能以及穩定的水相環境。但是,需要清除的小分子污染通常只比目標蛋白小10-100倍,所以并不是所有截留分子量規格的膜都可以達到相同的分離效果。因此,在純化大分子物質的應用中,選擇*的膜截留分子量尤為重要。

 

目的:

比較使用截留分子量分別為20kD、50kD和100kD的Float-A-Lyzer® G2 即用型透析裝置(FAL-G2)透析24h后的相對分離效果,實驗處理目標為截留抗體(IgG,166kD),并清除不需要的小分子物質:分子量比抗體小100倍的維他命B12(Vit B12,1.35kD)以及分子量比抗體小10倍的細胞色素C(Cyt C,12.4kD)。

其次,為透析應用建立通用的*截留分子量確定方法,如蛋白純化。

方法:

1. 3種不同分子量溶液制備如下:目標蛋白(IgG-166kD:1 mg/ml 0.9% PBS),1/10分子量污染物(細胞色素C-12.4kD:0.2 mg/ml 0.9%PBS)和1/100分子量污染物(維他命B12-1.35kD:0.2mg/ml 0.9% PBS)。

2. 9個FAL-G2(5ml容量規格)每個上樣4ml溶液,具體設置如下:IgG分別上樣至20kD、50kD和100kD截留分子量膜管;Cyt C分別上樣至20kD、50kD和100kD截留分子量膜管;Vit B12分別上樣至20kD、50kD和100kD截留分子量膜管。

3. 9個FAL-G2均于室溫下在獨立的透析容器中透析24h,每個透析容器包括1L 的0.9% PBS緩沖液,并分別于3h和8h時置換新鮮緩沖液。

4. 在透析開始后0、3、8和24h,分別從每個 FAL-G2取出200μl 測試樣品,用0.9% PBS以1:4 稀釋,并用紫外可見分光光度計檢測稀釋后溶液濃度(IgG檢測波長為280nm,Cyt C檢測波長為406nm,Vit B12檢測波長為366nm)。

5. 計算36個測試樣品稀釋前濃度,與透析前原始濃度比較(0h 測試樣品),確定每種截留分子量FAL-G2(20kD、50kD和100kD)在3個時間點(3、8和24h)的溶質截留百分比。


結論 :

IgG純化實驗總體的截留分子量效率為:100kD > 50kD > 20kD;100kD 為IgG純化的*截留分子量。


從不同截留分子量的截留曲線可以看到,50kD和100kD膜可在24h內有效清除維他命B12(1/100分子量污染物);而20kD 截留分子量大約需要36h。只有100kD截留分子量可有效清除細胞色素C(1/10分子量污染物),*清除需要2-3天。20kD和50kD截留分子量不能有效清除細胞色素C。


 

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