[預期應用]

本試劑盒運用雙抗體夾心ELISA法定量測定人血清、血漿、組織勻漿、細胞培養上清 或其它相關生物液體中IL8含量。

[試劑盒內容]

[需自備的設備及試劑]

1、450±10nm濾光片的酶標儀（建議儀器使用前提前預熱）

2、單道或多道微量加液器及吸頭

3、稀釋樣品的EP管

4、蒸餾水或去離子水

5、吸水紙

6、盛放洗液的容器

[操作步驟]

1、 加樣：分別設標準孔、待測樣品孔、空白孔。設標準孔7孔，依次加入100μL不同濃度的標準品（見試劑準備2）。空白孔加100μL（見試劑準備第二步zui后一管），余孔加待測樣品100μL，酶標板加上覆膜，37^oC溫育2小時。

2、 棄去液體，甩干，不用洗滌。

3、 每孔加檢測溶液A工作液100μL（臨用前配制），酶標板加上覆膜，37^oC溫育1小時。

4、 棄去孔內液體，每孔用350μL的洗滌液洗滌，浸泡1-2分鐘，吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體，在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次（也可輕拍將孔內液體拍干），重復洗板3次。zui后一次洗滌后，要把孔內的洗滌液*甩干。自動洗板機亦可。

5、 每孔加檢測溶液B工作液（臨用前配制）100μL，加上覆膜，37^oC溫育30分鐘。

6、 棄去孔內液體，甩干，洗板5次，方法同步驟4。

7、 每孔加底物溶液90μL，酶標板加上覆膜，37^oC避光顯色（反應時間控制在15-25分鐘，不要超過30分鐘。當標準孔的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯時，即可終止）。

8、 每孔加終止溶液50μL，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現顏色不勻一，請輕輕晃動酶標板以使溶液混合均勻。

9、 在確保酶標板底無水滴及孔內無氣泡后，立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度（O.D.值）。

注意：

1、 試劑準備：準備一次實驗所需要的酶標條，其它的可從微孔板上拆下，密封，按照說明書要求保存，以備下次使用。

2、 加樣：實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。加樣時注意不要有氣泡，將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。加樣或加試劑時，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的“預溫育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。因此，一次加樣時間（包括標準品及所有樣品）控制在10分鐘內。推薦設置復孔進行實驗。

3、 溫育：為防止樣品蒸發，實驗時請將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內，以避免液體蒸發，洗板后應盡快進行下步操作，任何時侯都應避免酶標板處于干燥狀態，同時應嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。

4、 洗滌：充分的洗滌非常重要，在每次洗滌過程中，都要將洗滌液*甩干。洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響zui后的酶標儀讀數。如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實 驗過程中。

5、 反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化（比如，每隔10分鐘觀察一次），如顏色較深，請提前加入終止液終止反應，避免反應過強從而影響酶標儀光密度讀數。

6、 底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。

7、 如果實驗室內濕度低于60%，推薦使用加濕器提高濕度水平。

[實驗原理]

將IL8抗體包被于96孔微孔板中，制成固相載體，向微孔中分別加入標準品或標本，其中的IL8與連接于固相載體上的抗體結合，然后加入生物素化的IL8抗體，將未結合的生物素化抗體洗凈后，加入HRP標記的親和素，再次*洗滌后加入TMB底物顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的IL8呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（O.D.值），計算樣品濃度。

[計算]

各標準品及樣本O.D.值扣除空白孔O.D.值后作圖（七點圖），如設置復孔，則應取其平均值計算。以標準品的濃度為縱坐標（或對數坐標），O.D.值為橫坐標（或對數坐標），繪出標準曲線（*方程式應依回歸方程計算的R²值來定，以R²值越趨近于1為好）。推薦使用專業制作曲線軟件進行分析，如curve expert 1.30，根據樣品O.D.值，由標準曲線查出相應的濃度，乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與O.D.值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的       O.D.值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

[檢測范圍]

15.6pg/mL-1,000pg/mL

[zui低檢測限]

6.4pg/mL

此值為20個空白樣品（即標準品稀釋液）測定的平均值加二倍標準差所對應的濃度。

[穩定性]

經測定，試劑盒在有效期內按推薦溫度保存，其活性降低率小于5%。

試劑盒穩定性由加速破壞試驗測定。具體方法為：將試劑盒放置于37^oC破壞3天后重新測定其各項指標，并比較破壞前后的測定值。（參考《中國生物制品規程》，生物試劑在37^oC每穩定一天，相當于4^oC保存2個月）。

注意：

為減小外部因素對試劑盒破壞前后檢測值的影響，實驗室的環境條件需盡量保持一致，尤其是實驗室內溫度、濕度及溫育條件。其次由同一實驗員來進行操作可減少人為誤差。

[實驗流程]

1、實驗前標準品、試劑及樣本的準備；

2、加樣（標準品及樣本）100μL，37^oC孵育2小時；

3、加檢測溶液A100μL，37^oC孵育1小時；

4、洗板3次；

5、加檢測溶液B100μL，37^oC孵育30分鐘；

6、洗板5次；

7、加TMB底物90μL，37^oC孵育15－25分鐘；

8、加終止液50μL，立即450nm讀數。

[說明]

1、 由于現有條件及科學技術水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進行全面的鑒定與分析，本產品可能存在一定的質量技術風險。

2、 zui終的實驗結果與試劑的有效性、實驗者的相關操作以及當時的實驗環境密切相關，請務必準備充足的標本備份。

3、 不同批次的同一產品可能會有少許差別，如：檢測限、靈敏度以及顯色時間等，請依據試劑盒內說明書進行實驗操作，電子版說明書僅作參考。

4、 只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測效果，不能混用其他制造商的產品。只有嚴格遵守本試劑盒的實驗說明才會得到*的檢測結果。

5、 在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發和微生物的污染，因為蛋白水解酶的干擾將導致出現錯誤的結果。

6、 剛開啟的酶聯板孔中可能會有少許水樣物質，此為正常現象，不會對實驗結果造成任何影響。請勿提前將酶標板從包裝袋里拿出。

7、 由于操作者不熟練、操作失誤或讀數儀程序選用錯誤等有可能會導致錯誤結果的產生。請使用者使用該產品前仔細閱讀說明書，調試好酶標儀，請使用配備有450±10nm濾光片的酶標儀，且該酶標儀測量范圍在0.001-3.000 O.D.或以上。

對ELISA操作不熟悉的可以參照視頻

8、 同一使用者在使用同一產品時，如不同時間訂購，也可能會因不同批次的少量差異產生不同結果，因此建議使用者在每次使用前均進行預實驗。

9、 試劑盒在出廠前均經過嚴格檢測，但由于運輸條件及各實驗室條件差異，可能會造成實驗結果與出廠結果不一致或不同批次試劑盒批間差大的情況，Uscn,Inc.會根據實際情況酌情處理。

10、本試劑盒未與其他廠家同類試劑盒或不同方法檢測同一目的蛋白的產品做對比，平行檢測可能會存在檢測結果不一致的情況。

11、本試劑盒有效期：六個月。

12、本操作說明同樣適用于48T試劑盒，但48T試劑盒所有試劑減半。

[警告]

本試劑盒中使用了稀硫酸作為終止液，其具有輕微腐蝕性，使用時應避免接觸衣物或眼、手等皮膚暴露部位。