【原理】

  間接紅細胞凝集（簡稱間接血凝）試驗是以紅細胞為抗原或抗體的載體，根據抗原和抗體的特異性反應，用已知抗原測定未知抗體或用已知抗體測定未知抗原的一種微量、快速、敏感的血清學方法。

  根據致敏用抗原或抗體的不同和參加反應成分的不同，間接血凝可分為以下3種。

  （一）間接血凝試驗

  將細菌多糖質或各種蛋白質抗原吸附在紅細胞表面上，該紅細胞稱為抗原致敏紅細胞，這種抗原致敏的紅細胞就具備了一種新的血清學性質，當與相應的抗血清相遇時，在適宜條件下，抗原就和抗體結合起來，因此紅細胞也被動地凝集起來。

  （二）反向間接血凝試驗

  將抗體致敏在紅細胞上，以測定相應的抗原。

  （三）間接血凝抑制試驗

  這一方法多是利用抗原致敏的紅細胞來測定可溶性抗原。其基本原理是將待測的可溶性抗原液中加入已知的抗體，待反應后，再加入抗原致敏的紅細胞，由于加入的抗體和待測抗原已先行結合，所以抗原致敏紅細胞的凝集被抑制。

【成分】

【制法】

  1.醛化紅細胞：

  (1）紅細胞：多種動物的紅細胞均可用于間接血凝試驗。一般多用綿羊和人“O”型紅細胞。我們認為綿羊紅細胞在多方面是滿意的，例如綿羊紅細胞容易大量獲得，不同批次致敏的紅細胞，波動范圍較小，血凝模式也比較穩定。

  (2）脫纖維血的制備：目前多用阿氏保存液來抗凝和保存紅細胞，方法是以無菌手續采集綿羊血或其他動物血液，按1:3（全血：保存液）的比例置于保存液中，立即充分搖動5~8分鐘，以防止發生凝塊，保存在4℃冰箱備用。

  (3）沉積紅細胞體積的測量：

   ①取薄層脫脂棉鋪于玻璃漏斗中。

   ②將保存液中的血液，通過上述漏斗，過濾在其他容器中以除去可能凝結的clot，記下濾液的總量。

   ③將過濾的血液混均，取10ml置于刻度離心管中，3000rpm30分鐘，輕輕取出離心管，沉積的紅細胞呈水平液面（水平轉頭離心），讀取紅細胞高度，從總量算出壓積紅細胞的總體積。

  (4）醛化紅細胞：新鮮紅細胞經醛類固定以后，可大大延長可用期。常用的醛類有甲醛、戊二醛及丙酮醛。不同醛類固定的紅細胞經致敏后，血凝反應的敏感性是不同的。雙醛化的紅細胞可提高血凝反應的敏感性。現僅例舉戊二醛固定法。

  戊二醛固定法：

   ①將綿羊或人“O”型紅細胞用0.15molpH7.2磷酸鹽緩沖液洗5次。

   ②把洗過的細胞和1％戊二醛溶液預先放在冰浴中，使冷卻到6~8℃。

   ③按沉積紅細胞10ml加入1％戊二醛溶液100ml計算，在冰浴中將1％戊二醛溶液加到洗過的紅細胞中，邊加邊搖，在冰浴中醛化45分鐘。

   ④將醛化的紅細胞用生理鹽水洗5次，然后配成10％醛化紅細胞，放普通冰箱備用。

  (5）醛化紅細胞的性質：

   ①醛化后的紅細胞，鏡檢一般呈兩面凸起的圓盤狀，有的呈輕度變形。大部呈散在狀態，也有的數個細胞堆在一起。

   ②醛化的紅細胞總體積有不同程度的增加，一般約増加10%~20%，體積增加的程度取決于醛化過程中紅細胞的破壞程度和洗滌時損失的多少而定。疊氮鈉可使醛化的紅細胞顏色變紅。

   ③醛化紅細胞抵抗低滲溶解和機械振蕩的能力甚強，反復凍融和在蒸餾水中皆不溶血，加溫60℃亦不被破環。凍干后重新懸浮，無明顯變化。

   ④醛化的紅細胞，不妨礙紅細胞表面化學基團對抗原或抗體的吸附。

  2.致敏方法：自Boyden (1951）用鞣酸處理紅細胞將蛋白質抗原致敏在紅細胞上以后，又研究出來多種新的致敏方法，這些方法各有其特點。今將我們常用的鉻-鞣酸法介紹如下。

  鉻-鞣酸法致敏紅細胞：

  (1)取10％醛化紅細胞0.3ml置于刻度離心管中，用4ml生理鹽水洗兩次，去上清；

  (2)加2ml用0.075molpH5.0醋酸緩沖液稀釋的抗體（0.05~1mg/ml)，混均，再加用生理鹽水稀釋的三氯化鉻（10~20μg/ml)2ml，混均，再加生理鹽水稀釋的1:20000鞣酸2ml，混均；

  (3)于37℃水浴中致敏10分鐘，此期間混均兩次；

  (4)離心去上清，用1%NRS洗兩次；

  (5)*后加4ml1%NRS,配成0.75％致敏紅細胞備用。

【用途】

  間接血凝技術，由于具有快速、敏感和簡便的優點，已成為廣泛應用的血清學方法之一，它不但是研究傳染病、寄生蟲病的病原學、免疫學和流行病學的良好手段，而且亦用于血液病病因、自家免疫病、過敏性疾病以及生長激素的研究。

【注意事項】

  1．致敏用蛋白質抗原或抗體的純度對血凝效果的好壞至關重要。如果抗原或抗體不純，雜蛋白可明顯地影響致敏效果，純度高、蛋白量少、效價高的抗體可獲得血凝效價高和穩定性好的抗體血球。

  2．致敏用抗原或抗體的理化性質。蛋白質抗原和抗體由于其本身固有的性質不同，致敏紅細胞的效果也不同，有的經純化后不經任何處理，即可獲得良好的致敏效果，而另外一些蛋日質抗原和抗體需使之發生輕度變性，才具有較好的致敏效果。

  3．用鞣酸方法致敏時，鞣酸濃度須合適，一般常用的濃度對1:20000。紅細胞經鞣酸處理后變為不穩定，而用1％正常兔血清鹽水來穩定鞣化的紅細胞，可得到較好效果。

  4．致敏的抗原或抗體濃度與血凝反應的敏感性和特異性明顯關系。合適量的致敏用抗原或抗體需先滴定。