百歐博偉生物：工業微生物產生菌的分離篩選是微生物資源開發的核心環節，目的是從復雜環境中分離出具有特定代謝功能（如產酶、抗生素、有機酸等）的菌株，并優化其生產性能。以下是詳細的步驟和關鍵點：

一、明確目標與設計實驗方案

1、確定目標產物

例如：抗生素、酶類（淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶）、有機酸（檸檬酸、乳酸）、多糖、生物表面活性劑等。

根據產物特性選擇篩選模型（如抑菌圈法、顯色底物法、產物濃度檢測等）。

2、樣本來源選擇

常規環境：土壤（尤其是富含有機質的土壤）、水體、植物根際、堆肥等。

特殊環境：高溫溫泉（嗜熱菌）、高鹽環境（嗜鹽菌）、酸性/堿性環境（嗜酸/嗜堿菌）等，以篩選微生物。

二、樣本預處理與富集培養

1、物理/化學預處理

加熱處理：如分離芽孢桿菌時，80℃水浴10分鐘殺死非芽孢菌。

選擇性抑制劑：添加抗生素（如抑制真菌）或調整pH（如酸性條件篩選乳酸菌）。

梯度稀釋：降低樣本復雜度，提高目標菌分離概率。

2、富集培養

使用含特定底物的培養基，促進目標菌生長。

示例：

篩選纖維素降解菌：以羧甲基纖維素為碳源。

篩選產蛋白酶菌：添加酪蛋白為底物，觀察透明水解圈。

三、初篩（Primary Screening）

1、平板篩選法

顯色反應：

淀粉酶菌：淀粉培養基+碘液染色，透明圈越大酶活性越高。

脂肪酶菌：含橄欖油和羅丹明B的培養基，紫外燈下顯熒光暈圈。

抑菌圈法：如抗生素產生菌抑制指示菌（如金黃色葡萄球菌）生長。

2、高通量篩選技術

微流控芯片、熒光標記、流式細胞術等，快速篩選高產菌株。

四、復篩（Secondary Screening）

1、搖瓶發酵與產物定量

對初篩陽性菌進行小規模發酵，檢測產物濃度（如HPLC、分光光度法）。

優化培養基成分（碳源、氮源、誘導劑）和培養條件（溫度、pH、溶氧）。

2、穩定性測試

連續傳代5~10次，觀察產物的遺傳穩定性。

五、菌種純化與鑒定

1、純化方法

平板劃線法、稀釋涂布法，確保獲得單菌落。

2、形態與生理生化鑒定

形態：菌落形態、革蘭氏染色、顯微鏡觀察（孢子、鞭毛等）。

生理生化：碳源利用、酶活性（氧化酶、過氧化氫酶）、耐鹽性等。

3、分子生物學鑒定

16S rRNA基因測序：確定菌株屬種（通用引物27F/1492R）。

功能基因檢測：如聚酮合酶基因用于抗生素產生菌鑒定。

六、菌株優化與保藏

1、誘變育種

紫外線、化學誘變劑、ARTP（常壓室溫等離子體）誘變，結合高通量篩選。

2、基因工程改造

CRISPR-Cas9敲除競爭代謝通路，過表達關鍵基因。

3、菌種保藏

短期：斜面培養基（4℃保存1~3個月）。

長期：甘油管（-80℃）或冷凍干燥保藏。

七、工業應用評估

1、發酵性能：生長速率、底物轉化效率、抗污染能力。

2、經濟性：培養基成本、產物提取難度。

3、安全性：是否產毒素、是否屬于致病菌（需符合生物安全等級）。

示例：產淀粉酶菌的分離流程

1、采樣：面粉廠周邊土壤。

2、富集：以可溶性淀粉為碳源的液體培養基，30℃振蕩培養48小時。

3、初篩：淀粉瓊脂平板，碘液顯色后挑選透明圈直徑大的菌落。

4、復篩：搖瓶發酵測定酶活（DNS法測還原糖）。

5、鑒定：16S rRNA測序確定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

通過系統化的分離篩選流程，結合現代分子技術，可高效獲得適用于工業生產的優良菌株。

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