在培養箱內對細胞相互作用進行熒光觀察，是一種能在接近細胞生理環境（穩定的溫度、濕度、CO?濃度等）下，實時、動態追蹤細胞間相互作用的技術，尤其適用于需要長時間觀察的實驗。以下是該技術的關鍵要點：

一、核心設備要求

要實現培養箱內熒光觀察，需專用設備組合，確保不干擾細胞存活且能精準捕捉熒光信號：

培養箱集成式熒光顯微鏡

直接將熒光顯微鏡模塊嵌入細胞培養箱內部，或通過密封接口連接外部顯微鏡，避免頻繁取出細胞導致環境波動。例如：

Incucyte® S3/S2（進口）：培養箱內集成熒光成像模塊，支持明場和多通道熒光（GFP、RFP 等），可長期自動拍攝。

國產 CytoSMART Lux3 FL：小型化培養箱內熒光顯微鏡，支持 3 通道熒光，通過 APP 遠程監控，適合中小規模實驗。

核心功能：維持 37℃、5% CO?、95% 濕度環境，避免熒光激發光對細胞的光毒性（需低強度 LED 光源）。

熒光標記策略

對目標細胞或分子進行特異性熒光標記，確保相互作用可被可視化：

細胞標記：用不同熒光染料（如 CFSE 標記細胞 A，CellTracker Red 標記細胞 B）區分兩種細胞，觀察其聚集、接觸或遷移軌跡。

分子標記：通過基因編輯（如 GFP 融合蛋白）標記細胞表面受體（如免疫細胞的 CD4、腫瘤細胞的 PD-L1），或配體（如細胞因子），實時追蹤分子在相互作用中的動態（如受體聚集、內化）。

相互作用特異性標記：如 “熒光共振能量轉移（FRET）”，當兩細胞表面分子結合時，供體熒光（如 CFP）向受體熒光（如 YFP）轉移能量，通過信號變化反映相互作用強度。

二、觀察與成像方法

時間序列成像

設定拍攝間隔（如每 10 分鐘 1 次），連續數小時至數天，記錄細胞相互作用的動態過程（如免疫細胞與腫瘤細胞的識別→接觸→殺傷，或神經元突觸形成）。

注意控制熒光激發時間和強度：過長或過強的激發光會導致細胞活性下降（光毒性），需通過預實驗優化參數（如每次曝光≤50ms，間隔≥30 分鐘）。

多通道與共定位分析

同時采集明場和多個熒光通道圖像（如 DAPI 染核 + GFP 標記細胞 A+RFP 標記細胞 B），通過軟件疊加分析細胞間的空間關系（如是否直接接觸、接觸區域的分子共定位）。

三、數據分析重點

結合時間序列熒光圖像，可通過軟件量化細胞相互作用的關鍵參數：

相互作用動態參數

接觸頻率：單位時間內兩細胞接觸的次數；

接觸時長：單次接觸持續的時間；

距離變化：細胞間中心距離隨時間的變化（反映趨近或遠離趨勢）。

熒光信號分析

熒光強度變化：如細胞接觸后，標記分子（如炎癥因子）的熒光強度升高，提示信號激活；

共定位系數：通過 ImageJ 或 CellProfiler 計算兩種熒光信號的重疊程度（如受體 - 配體在接觸界面的共定位）。

細胞行為關聯

結合細胞運動軌跡（如通過 TrackMate 插件追蹤），分析相互作用與細胞遷移速度、方向改變的關系（如 T 細胞接觸靶細胞后是否減速并停留）。

四、應用場景

免疫學：觀察 T 細胞與樹突狀細胞的免疫突觸形成、NK 細胞對靶細胞的識別與殺傷過程。

腫瘤學：追蹤巨噬細胞與腫瘤細胞的相互作用（如 “吞噬” 或 “促轉移” 傾向），或腫瘤細胞間的抱團遷移。

神經科學：記錄神經元突起與膠質細胞的接觸動態，或突觸形成過程中熒光標記蛋白（如突觸素 Synapsin-GFP）的聚集。

發育生物學：觀察胚胎發育中細胞間的黏附、分化信號傳遞（如干細胞與滋養層細胞的相互作用）。

五、注意事項

環境穩定性：確保培養箱內溫度、CO?濃度無波動（避免成像時開門或設備散熱影響）。

光毒性與漂白：優先選擇低光毒性熒光染料（如 Alexa Fluor 系列），并降低激發光強度和曝光時間。

圖像存儲與處理：長時間成像會產生大量數據（如 2000 萬像素圖像每小時 1GB），需配備大容量存儲和自動化分析軟件（如 Incucyte Analysis Software、Harmony）。

通過該技術，可直觀揭示細胞相互作用的動態規律，為理解生理或病理機制提供關鍵可視化證據。