在藥物研發(fā)與生物標志物分析中，磷酸化蛋白的檢測是評估信號通路激活與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，目前，常用的檢測方法有均相檢測技術(shù)(HTRF、Lance和AlphaLISA)、流式細胞術(shù)（Flow Cytometry）和Western Blot（WB），這三種檢測方法各有什么特點？我們?nèi)绾芜M行選擇呢？各位小伙伴們請往下看！

快速選擇指南

高通量篩選？ → 選HTRF和AlphaLISA

需單細胞數(shù)據(jù)？ → 選流式細胞術(shù)

驗證未知靶點？ → 選WB

組合策略：WB用于機制探索，流式驗證細胞亞群效應(yīng)，HTRF完成大規(guī)模藥效評價，可兼顧效率與深度。

均相檢測技術(shù)（HTRF/LANCE&AlphaLISA）

01

均相檢測原理

均相檢測技術(shù)包括HTRF、Lance和AlphaLISA，以均相的Phospho-STAT3 （Tyr705）檢測試劑盒為例，試劑盒中含有一對檢測抗體，可分別識別STAT3序列和Tyr705磷酸化位點，且這兩個抗體分別攜帶有供體和受體，當這兩種抗體同時與Phospho-STAT3 (Tyr705)結(jié)合時，供體與受體在空間上相互靠近，從而產(chǎn)生檢測信號，通過酶標儀檢測該信號強度，其數(shù)值與樣品中磷酸化STAT3蛋白的濃度呈正相關(guān)。

Principle of HTRF Phospho-STAT3（Tyr705）kit assay.

Principle of AlphaLISA™ SureFire® Ultra™ Phospho-STAT3

02

HTRF/Lance VS AlphaLISA的技術(shù)對比

03

均相檢測優(yōu)勢

均相檢測：無需洗滌步驟，減少操作誤差，適合高通量篩選（如384/1536孔板）。

CV值低：數(shù)據(jù)穩(wěn)定，整版均一性較好，重復(fù)性高。

節(jié)省樣本：僅需少量細胞裂解液（10–16 μL），適合珍貴樣本（如PBMC）。

快速高效：無需包被和洗滌，實驗僅需2小時，適合高通量檢測。

高靈敏度與特異性：時間分辨熒光技術(shù)降低背景干擾，可檢測低豐度磷酸化蛋白（如p-STAT3、p-MEK）。

劣勢：

如需區(qū)分細胞亞群：建議用HTRF/AlphaLISA進行初篩后再結(jié)合流式進行細胞亞群的分選。

HTRF Protein detection kit protocol

AlphaLISA Protein detection kit protocol

流式細胞術(shù)（Flow Cytometry）

檢測原理

固定破膜：甲醛固定細胞，甲醇/去垢劑破膜暴露磷酸化蛋白。

抗體染色：熒光標記抗-p-protein抗體（如p-STAT5-PE）結(jié)合靶標。

信號生成：激光激發(fā)熒光染料（如PE染料（發(fā)射峰578 nm）通過575/26 nm濾片檢測），強度反映磷酸化水平。

Principle of Flow Cytometry assay

優(yōu)勢

單細胞分辨率：可分析異質(zhì)細胞群體中不同亞群的磷酸化狀態(tài)。

多參數(shù)檢測：可同時分析表面標志物和胞內(nèi)磷酸化蛋白（如p-ERK、p-AKT與CD標記共檢測）。

動態(tài)范圍廣：適合檢測微弱或高度磷酸化的信號，尤其適用于原代細胞或稀有細胞樣本。同如上均相檢測技術(shù)。

劣勢：
低通量：胞內(nèi)染色步驟復(fù)雜（固定、破膜易影響表位），實驗流程較久，不適合高通量篩選。

設(shè)備成本高：流式細胞儀和維護費用較高，數(shù)據(jù)分析需專業(yè)軟件。

Flow Cytometry detection protocol

蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）

檢測原理

磷酸化依賴的分子量偏移：磷酸化導(dǎo)致ERK構(gòu)象變化，在SDS-PAGE中p-ERK較ERK遷移慢（表觀分子量差異約1-2 kDa）。

抗體識別：一抗特異性識別靶標磷酸化蛋白，二抗偶聯(lián)HRP或熒光染料，用于信號放大。

Principle of western blot assay

優(yōu)勢

低成本：基礎(chǔ)實驗室均可開展，適合預(yù)算有限的研究。

劣勢：

低通量：步驟繁瑣（電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育抗體），耗時長達1–2天。

樣本需求大：需較多細胞量（通常>10^6細胞/條件），難以分析微量樣本。

重復(fù)性挑戰(zhàn)：轉(zhuǎn)膜效率、抗體批次差異可能影響結(jié)果。

Western blot detection protocol

方法對比總結(jié)

結(jié)語與建議

在抗體藥物研發(fā)中，磷酸化蛋白檢測技術(shù)的選擇需要綜合考量通量、分辨率、成本和樣本需求。隨著研究精準化需求的提升，多技術(shù)聯(lián)用已成為趨勢。

我們推薦：

初篩階段：HTRF/AlphaLISA高通量篩選

深入分析：流式細胞術(shù)單細胞解析

機制驗證：Western Blot靶點確認

Revvity提供從靶點發(fā)現(xiàn)到臨床申報的全周期檢測解決方案，如需獲取個性化方案或技術(shù)咨詢，歡迎隨時聯(lián)系我們的專業(yè)團隊。

Revvity磷酸化試劑盒(部分產(chǎn)品)