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關稅大戰按下暫停鍵，流式er驚魂未定，美國產試劑漲價預警，流式實驗如何降本增效？
Bio X Cell（國內一級授權代理商生物）以其高品質的體內功能級抗體享-譽全-球，鮮為人知的是B家還有不少在體外實驗中應用廣泛的隱藏好物，今天我們就來聊聊用于Fc受體阻斷的抗小鼠CD16/CD32抗體。
為什么要阻斷Fc受體
抗體的結構是一個 Y 型，由高度可變的抗原結合片段（Fab段，fragment antigen-binding）和可結晶片段（Fc段，fragment crystallizable）組成，前者負責識別和結合抗原，后者通過結合Fc受體（FcR）介導其他免疫途徑的效應功能，比如抗體依賴性細胞介導的細胞毒性和吞噬作用，抗原提呈，以及趨化因子和細胞因子的分泌[1,2]。
而在基于抗原-抗體反應的細胞分析比如流式實驗中，Fc受體與抗體Fc段的結合卻會成為干擾因素，產生抗原檢測的假陽性信號。Fc受體阻斷就是在檢測抗體孵育之前先封閉掉Fc受體。
圖1 抗體結構示意
Fc受體的表達與分類
抗體的恒定區決定了抗體的同種型，Fc受體根據所結合的抗體同種型分類，以日常實驗和臨床藥物研發中使用最多的IgG為例，其Fc受體稱為FcγR。人和小鼠有三個FcγR亞家族，包括高親和力、能夠結合單體IgG的FcγRI（CD64），低親和力、主要結合抗原-抗體免疫復合物（IC IgG）的FcγRII（CD32）和FcγRIII（CD16）。此外，小鼠還有獨-特的高親和力 FcγRIV（CD16.2）[2]。
大部分免疫細胞尤其是髓系細胞表達FcγR，比如在小鼠中，巨噬細胞和單核細胞高表達幾乎所有類型FcγR，樹突狀細胞也表達多種FcγR，中性粒細胞表達FcγRIV（CD16.2）和FcγRIII（CD16），B細胞主要表達FcγRII（CD32），NK細胞表達FcγRIII（CD16） [2,3]。
圖2 小鼠FcγR的表達模式及與小鼠IgG1、IgG2a/c和IgG2b的親和力[2]
什么時候要做Fc受體阻斷
研究高表達Fc受體的細胞類型，比如單核細胞和巨噬細胞，必須要做Fc受體阻斷。Andersen等人詳細測定了流式實驗中的Fc受體結合，發現人外周血單個核細胞和單核來源巨噬細胞與小鼠IgG1和IgG2a有很強的非特異結合，而商業化Fc 阻斷劑、小鼠或人血清，或是高濃度的小鼠或人IgG都能消除這種非特異信號[4]。
如果關注的不是免疫細胞，比如腫瘤細胞，當樣本可能富含免疫細胞，像是實體腫瘤的細胞懸液，仍然需要避免腫瘤浸潤白細胞的影響。一般來講，實體組織來源的原代細胞在做流式實驗時都需要進行Fc受體阻斷。另外，對于表達水平較低的指標，或是較為稀有的細胞，Fc受體阻斷能夠降低噪音，提高靈敏度。
圖3 人外周血單個核細胞使用不同Fc受體阻斷試劑時不同同型對照的中位熒光強度[4]
然而并非所有流式實驗都需要進行Fc受體阻斷。明確的不表達Fc受體的細胞系，或是高純度的不表達Fc受體的細胞，比如腫瘤細胞、上皮細胞、T細胞，沒有抗體結合Fc受體的風險。而使用Fc段突變改造消除Fc受體結合能力的重組抗體能夠從根源上避免這類假陽性信號。
Bio X Cell隱藏好物，抗小鼠CD16/CD32抗體
大家可能從前面的參考文獻已經發現了，多種試劑都能阻斷Fc受體。其中商品化的Fc受體阻斷劑多為純化的Fc受體的抗體，比如常見的小鼠Fc受體阻斷劑就是小鼠CD16/CD32的抗體，比血清的批間一致性更高，比所有IgG混合物的特異性更強。這里我們推薦B家抗小鼠CD16/CD32抗體，助您實驗降本增效：
信息透明：成分、克隆和濃度信息一-應俱-全，InVivoMAb anti-mouse CD16/CD32（#BE0307）克隆2.4G2，同種型為大鼠IgG2b，與小鼠 CD16和 CD32的共有表位特異性反應，還有報道能非特異結合 FcγRI。注意如果在免疫檢測中需要使用二抗，不能用抗大鼠 IgG2b抗體。
充分驗證：克隆2.4G2的分離與鑒定最早發表于1979年[5]，現在是最-常用的小鼠Fc受體阻斷劑克隆之一。根據CiteAb網站統計，#BE0307的引用文獻已達280篇，覆蓋流式、免疫熒光、磁珠分選和功能實驗等諸多應用。
廣泛適用：#BE0307屬于InVivoMAb系列，高純度（>95%），低內毒素（<2EU/mg），尤其適合后續功能實驗，甚至可以用于體內阻斷。Bio X Cell還提供內毒素低于1EU/mg的InVivoPlus版本（#BP0307）。
文獻案例
Arlauckas等人[6]為了探究為何有時腫瘤不響應PD-1單抗治療，利用體內熒光顯微成像追蹤PD-1單抗在腫瘤微環境中的動態，發現抗體藥在給藥后幾分鐘內即有效結合瘤浸潤的PD-1? CD8? T細胞，但是隨后從T細胞表面被腫瘤相關巨噬細胞（TAM）“搶奪”并內吞，限制了藥物的持續作用。隨后應用抗小鼠CD16/CD32抗體進行體內外實驗，證實TAM對PD-1抗體的“搶奪”依賴于Fc-FcγR的互作。
o 體外共培養實驗：將熒光標記的PD-1抗體與T細胞預孵育，再與骨髓來源巨噬細胞共培養，在體系中加入抗體阻斷FcγRII/III，能夠顯著減少PD-1抗體熒光從T細胞向巨噬細胞的轉移。
o 小鼠體內實驗：在PD-1單抗給藥前連續5天每天腹腔注射200μg小鼠CD16/CD32抗體，阻斷外周巨噬細胞上的FcγRII/III，顯著延長PD-1單抗與腫瘤浸潤CD8? T細胞的結合時長，并且徹-底消除了不響應者，聯合給藥在所有小鼠中實現腫瘤消除。
圖4 體外共培養實驗證實PD-1抗體從T細胞表面向巨噬細胞的轉移由FcγRII/III介導
圖5 體內阻斷FcγR在MC38小鼠模型中延長PD-1單抗與T細胞的結合時長，提高治療效果
最后悄悄說，抗小鼠CD16/CD32抗體延續了B家體內抗體傳統，相同克隆按實際抗體含量計算，性-價-比超-高，很多機智的大牛實驗室已經用來發頂刊啦。如果您想了解這一抗體的更多應用案例、使用方法和購買信息，歡迎聯系我們或咨詢我們在中國的一級授權代理商欣博盛生物。
參考文獻
1. Nimmerjahn, F, Ravetch, JV (2008) Fcγ receptors as regulators of immune responses. Nat Rev Immunol. 8(1):34-47. doi: 10.1038/nri2206.
2. Galvez-Cancino, F, et al (2024) Fcγ receptors and immunomodulatory antibodies in cancer. Nat Rev Cancer. 24(1):51-71. doi: 10.1038/s41568-023-00637-8.
3. Guilliams, M, et al (2014) The function of Fcγ receptors in dendritic cells and macrophages. Nat Rev Immunol. 14(2):94-108. doi: 10.1038/nri3582.
4. Andersen, MN, et al (2016) Elimination of erroneous results in flow cytometry caused by antibody binding to Fc receptors on human monocytes and macrophages. Cytometry A. 89(11):1001-1009. doi: 10.1002/cyto.a.22995.
5. Unkeless, JC (1979) Characterization of a monoclonal antibody directed against mouse macrophage and lymphocyte Fc receptors. J Exp Med. 150(3):580-596. doi: 10.1084/jem.150.3.580.
6. Arlauckas, SP, et al (2017) In vivo imaging reveals a tumor-associated macrophage-mediated resistance pathway in anti-PD-1 therapy. Sci Transl Med. 9(389):eaal3604. doi: 10.1126/scitranslmed.aal3604.
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