一、背景

細胞免疫熒光檢測服務(wù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素制成熒光標記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在細胞或組織中形成的抗原抗體復合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光（黃綠色或桔紅色），可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。

免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique）是在免疫學、生物化學和熒光成像系統(tǒng)基礎(chǔ)上建立起來的檢測技術(shù)。技術(shù)原理是根據(jù)抗體-抗原特異結(jié)合，以熒光標記抗體示蹤組織或細胞內(nèi)相應(yīng)抗原。免疫熒光技術(shù)因特異性強、靈敏度高和操作簡便的優(yōu)勢廣泛應(yīng)用于免疫學、微生物學、病理學、腫瘤學以及臨床檢驗等生物學和醫(yī)學。

免疫學的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性，所以當抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時，只要知道其中的一個因素，就可以查出另一個因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。

二、技術(shù)流程

1、細胞爬片：將細胞按20%-30%的匯合度接種到24孔細胞培養(yǎng)板中的圓形蓋玻片上。

2、細胞固定：4%冷的多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗三遍。

3、細胞通透：Triton X-100通透20分鐘，PBS洗三遍。

4、封閉：用與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘，PBS洗三遍。

5、一抗孵育：一抗4度濕盒內(nèi)過夜，也可37度2小時，PBS洗三遍。

6、二抗孵育：二抗室溫孵育2小時或者37度1.5小時（避光），PBS洗三遍。

7、DAPI染核：在二抗孵育1小時后加入終濃度為100ng/ml的DAPI繼續(xù)孵育。然后可在熒光顯微鏡下觀察或直接封片保存。

8、甘油封片：在載玻片上滴一小滴甘油，小心地將細胞爬片從細胞培養(yǎng)板中取出來，種植有細胞的一面朝下輕輕的蓋在甘油上，避免產(chǎn)生過氣泡。4度孵育過夜晾干。

三、應(yīng)用

細胞免疫熒光檢測服務(wù)可用于循環(huán)腫瘤細胞檢測：

外周血循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells,CTCs)存在于多種惡性腫瘤中,其檢測對于腫瘤早期診斷、預后分析、療效檢測以及個體化治療等眾多方面具有重要的臨床意義,并因能夠?qū)崟r檢測、創(chuàng)傷小等優(yōu)點成為備受關(guān)注的“液態(tài)活檢”。基于ISET原理,通過前期研究建立了改良ISET檢測CTCs技術(shù)體系,主要工作基礎(chǔ)包括：建立了改良ISET手工實驗裝置、改良了染色方法、提高了腫瘤細胞截留率,研究結(jié)果表明該技術(shù)體系檢測效果較為理想,腫瘤細胞截留率可達80%以上,染色后的細胞形態(tài)學結(jié)構(gòu)可辨,能區(qū)分典型的CTCs與正常白細胞。

聯(lián)合細胞免疫熒光技術(shù),建立ISET聯(lián)合細胞免疫熒光檢測循環(huán)腫瘤細胞技術(shù)體系,并通過檢測23侈Ⅲ/Ⅳ期腫瘤患者外周血循環(huán)腫瘤細胞進行臨床預研究。通過對課題組前期ISET技術(shù)進行優(yōu)化,聯(lián)合細胞免疫熒光技術(shù),建立了ISET-ICC檢測CTCs技術(shù)體系。通過細胞蠟塊-免疫組化技術(shù)體系,驗證了ISET-ICC技術(shù)體系分離獲得的CTCs性質(zhì),證實了EMT的存在。

通過與CellSearch、CTC-Biopsy兩種CTCs檢測方法對比,證實了ISET-ICC技術(shù)具有臨床應(yīng)用可行性,能夠用于肺癌、食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌、腎癌、肝癌患者的CTCs檢測。ISET聯(lián)合細胞免疫熒光技術(shù)能檢測到上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的循環(huán)腫瘤細胞以及循環(huán)腫瘤微栓,而這兩種細胞是造成CellSearch假陰性的主要原因。ISET聯(lián)合細胞免疫熒光技術(shù)能夠輔助鑒定CTC-Biopsy方法富集的CTCs。

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