使用奧林巴斯 CX33 顯微鏡進(jìn)行熒光觀察顆粒樣品（如熒光標(biāo)記的化妝品顆粒、生物微粒等），需結(jié)合其硬件特性與熒光成像原理，以下是具體操作流程及注意事項(xiàng)：

一、樣品預(yù)處理（針對(duì)顆粒樣品）

分散與富集

若顆粒團(tuán)聚，超聲處理 1-2 分鐘（功率≤50W）使其均勻分散；

微米級(jí)顆粒：通過 0.45μm 濾膜過濾，將顆粒截留于膜表面，提高觀察密度；

納米顆粒：可選負(fù)染色法（2% 磷鎢酸）增強(qiáng)對(duì)比度，或直接利用表面修飾的熒光基團(tuán)（如羅丹明 B 標(biāo)記）。

熒光標(biāo)記

無熒光顆粒：用對(duì)應(yīng)激發(fā)波長(zhǎng)的熒光染料染色（如綠色熒光選 FITC，紅色選 Cy3）；

標(biāo)記后需清洗去除游離染料，避免背景干擾。

二、設(shè)備配置與參數(shù)設(shè)置

熒光附件安裝

插入緊湊型熒光照明器（需額外配置），LED 光源預(yù)對(duì)中，無需手動(dòng)校準(zhǔn)；

聚光鏡切換至FL（熒光）位置，阻擋透射光，減少背景雜光。

濾光片選擇（根據(jù)熒光類型）

綠色熒光顆粒（如 FITC、GFP）：藍(lán)光激發(fā)（BP470-490nm），發(fā)射光 BP510-550nm；

紅色熒光顆粒（如羅丹明、Cy3）：綠光激發(fā)（BP530-550nm），發(fā)射光 BP570-620nm；

若為多色標(biāo)記，需依次單通道采集，避免串色。

光源與光闌調(diào)節(jié)

LED 光源強(qiáng)度調(diào)至 50%-70%（延長(zhǎng)熒光壽命，避免淬滅）；

孔徑光闌縮小至 50%-70%（增強(qiáng)對(duì)比度，減少散射光）。

三、熒光觀察操作步驟

低倍鏡定位（4X/10X）

明場(chǎng)下找到顆粒密集區(qū)域，記錄坐標(biāo)；

切換熒光通道，觀察熒光分布（如脂質(zhì)體顆?？赡苓吘墴晒庠鰪?qiáng)）。

高倍鏡精細(xì)觀察（40X/100X 油鏡）

100X 油鏡需滴加香柏油，微調(diào)焦至顆粒邊緣清晰（避免壓碎玻片，工作距離 0.13mm）；

觀察形態(tài)（球形 / 片狀）、熒光均勻性（如納米顆粒是否團(tuán)聚導(dǎo)致熒光聚集）。

動(dòng)態(tài)或三維觀察（可選）

若需時(shí)間序列成像，開啟 LED 低光毒性模式（減少光損傷）；

配合 CellSens 軟件進(jìn)行 Z-stack 掃描，重建顆粒三維分布（需載物臺(tái)高精度升降）。

四、圖像優(yōu)化與分析

對(duì)比度增強(qiáng)

柯勒照明下調(diào)節(jié)聚光鏡高度，確保光斑均勻覆蓋視野；

暗場(chǎng)模式輔助觀察透明顆粒的熒光散射（需暗場(chǎng)聚光鏡附件）。

量化分析

粒徑測(cè)量：CellSens 或 ImageJ 標(biāo)尺功能，統(tǒng)計(jì)≥100 個(gè)顆粒的 D10/D50/D90；

熒光強(qiáng)度：標(biāo)準(zhǔn)化背景后，分析單顆粒或區(qū)域平均強(qiáng)度（反映標(biāo)記效率）；

形態(tài)分類：球形度、長(zhǎng)寬比等參數(shù)，區(qū)分團(tuán)聚與分散狀態(tài)。

多模態(tài)聯(lián)用

白光 + 熒光疊加成像，定位熒光顆粒的物理位置；

結(jié)合偏光模式，分析礦物顆粒的雙折射（如二氧化鈦的晶型差異）。

五、注意事項(xiàng)

防熒光淬滅：快速拍照，避免長(zhǎng)時(shí)間激發(fā)；可添加抗淬滅劑（如 DABCO）。

載玻片選擇：使用薄型蓋玻片（0.17mm），避免光路偏差；熒光樣品需避光保存。

物鏡維護(hù)：油鏡使用后及時(shí)用二甲苯擦拭，防止香柏油殘留影響透光率。

環(huán)境控制：關(guān)閉室內(nèi)光源，減少雜散光；空調(diào)控溫（25℃±1℃），避免熱漂移。

總結(jié)

奧林巴斯 CX33 通過LED 熒光照明 + UIS2 光學(xué)系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)顆粒樣品的高對(duì)比度熒光觀察，尤其適合微米級(jí)熒光標(biāo)記顆粒的形態(tài)分析與定量研究。結(jié)合樣品預(yù)處理（分散 / 染色）、濾光片精準(zhǔn)匹配及軟件分析，能有效支撐化妝品、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的顆粒表征需求。

（注：CX33 需選配熒光模塊，基礎(chǔ)機(jī)型僅支持明場(chǎng) / 暗場(chǎng)，升級(jí)后可實(shí)現(xiàn)藍(lán)激發(fā)熒光觀察。）