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重組菌株高通量涂布：聲波移液的創(chuàng)新解決方案
合成生物學是一門基于工程化原理設計、構建和優(yōu)化生物系統(tǒng)的新興交叉學科。分子克隆是合成生物學的基礎技術，而平板涂布作為分子克隆中的核心步驟，對確保重組質粒純度和實驗可重復性至關重要，但傳統(tǒng)手工涂布（96樣本/96平板）需90分鐘，自動化系統(tǒng)（如QPix 460）仍需30分鐘，通量不足且耗材量大，制約高通量應用，亟需開發(fā)高吞吐、低耗材的微型化涂布新技術。
Echo®移液系統(tǒng)采用動態(tài)流體分析（Dynamic Fluid Analysis™，DFA）和聲學微滴噴射（Acoustic Droplet Ejection，ADE）的專利技術（U.S.Patent 6,938,995），該技術無需吸頭，使用非接觸式移液的方式完成nL級體積的菌液至固體培養(yǎng)基的轉移，極大地提高涂布實驗的效率，同時降低耗材和硬件成本。
nL級移液，減小反應體系，節(jié)約樣品和試劑成本；
無需吸頭等耗材，更低的耗材成本；
無液體殘留，更高的移液準確度，更低的移液CV值；
非接觸移液，消除交叉污染；
靈活移液，可從來源板任意孔移液至目的板任意孔；
快速移液，3分鐘內(nèi)完成25nL 384孔板的移液。
實驗設計-從頭構建質粒與Echo高通量平
采用同源序列引物分別擴增載體PL2214（9330bp）及目的片段C（1443bp）、D（1581bp）、E（1656bp），通過同源重組構建重組質粒。每組基因設兩個平行（C1/C2、D1/D2、E1/E2），以減少實驗誤差，確保結果的可靠性。將C1/D1/E1菌液進行梯度稀釋（原液、10×、20×、50×）；C2/D2/E2菌液濃縮10倍后稀釋（原液、10×、50×、100×），共制備24個稀釋樣本。使用Echo 525將稀釋菌液以25nL/液滴轉移至384孔PP板，每個樣本點樣48個單克隆至含Amp的LB 8格板。
界面友好，填空以及鼠標點選的編寫方式；
自帶移液模板，支持多種溶液類型同時移液；
靈活移液，支持來源板任意孔到目的板任意孔的移液；
數(shù)據(jù)追蹤，自動生成移液報告。
實驗結果：
本應用方案成功建立了基于聲波轉移的高精度菌落陣列構建方法：
針對3種質粒構建體系，分別設置8個梯度稀釋條件，通過Echo 525非接觸式轉移系統(tǒng)將每個樣品以48個25nL液滴（共計1.2μL/樣品）精準分配至SBS標準8格板。實驗證實：
原液直接涂布即可獲得有效單克?。?/p>
10倍濃縮菌液產(chǎn)生的單克隆數(shù)量顯著高于未濃縮組。
圖2：使用Echo 525做平板涂布，平板上長出的單菌落
菌落PCR驗證結果：
隨機挑選18個單菌落做菌落PCR，17個擴增出特異性目的條帶（陽性率94.4%），1個無擴增，所有產(chǎn)物送測序驗證。
圖3：菌落PCR電泳結果
測序驗證結果：
17個陽性PCR產(chǎn)物經(jīng)測序分析，均顯示純凈單峰，序列與預期完全匹配，證實17個菌落均為目標單克隆，測序結果與菌落PCR檢測結果一致。
圖4：一代測序驗證單克隆
本研究通過菌落PCR和測序驗證了Echo 525涂布系統(tǒng)的單克隆可靠性：
在18個隨機挑選的克隆中，94.4%（17/18）呈現(xiàn)單一目的條帶和純凈測序峰圖，證實該系統(tǒng)產(chǎn)生的菌落均為單克隆?；诖耍覀兘ㄗh優(yōu)化工作流程：
直接使用收菌后濃縮10倍的菌液進行Echo涂布，可提升操作效率；
根據(jù)實際轉化效率，可適當減少單樣本轉移液滴數(shù)量（當前48滴/樣本）。該方案質粒構建成功率顯著高于常規(guī)方法。
結論
Echo 525適配高通量菌株構建實驗體系，解決平板涂布耗時長、效率低、耗材使用量大等問題，以構建96個重組質粒的平板涂布為例：
一. 效率提升：
*按照每個樣本轉移12個菌液液滴計算
二. 成本優(yōu)化
耗材節(jié)省
平板用量：Echo525僅需3塊SBS標準板（vs手工96塊板/QPix 12塊8格板）
- 較手工降低97%（96板→3板）
- 較QPix降低75%（12板→3板）
輔助耗材：零吸頭消耗（傳統(tǒng)方法需96個無菌吸頭）
硬件需求節(jié)省
與手工涂布或QPix 460涂布相比，Echo高通量平板涂布所需的溫控培養(yǎng)箱數(shù)量減少97%或75%，大大降低了溫控培養(yǎng)箱的硬件成本。
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