罕見病患兒KJ剛出生就確診氨基甲酰磷酸合成酶1（CPS1）缺陷癥，因肝臟無法正常代謝氨，面臨腦損傷甚至死亡風險，傳統(tǒng)治療需依賴排氮藥物、嚴格低蛋白飲食及肝移植。研究團隊借助堿基編輯技術，針對KJ來自父母雙方的致病突變，僅用6個月完成全流程開發(fā)，從構建攜帶相同突變的小鼠模型與細胞系、跨物種（猴子）安全性驗證，到定制化藥物“k-abe”的生產。2024年2月，KJ接受兩次靜脈注射后，血氨濃度、谷氨酰胺水平等關鍵生化指標顯著改善，體重從同齡嬰兒第9百分位躍升至第26百分位，神經系統(tǒng)未受進一步損傷且展現(xiàn)正常活力。

這一療法不僅突破了“單患者定制化基因治療”的技術壁壘，更通過科研、產業(yè)與醫(yī)療系統(tǒng)的高效協(xié)同，為罕見病治療開創(chuàng)了“精準定制”的全新范式。諾貝爾獎得主Jennifer Doudna盛贊其為“醫(yī)學史里程碑”，標志著人類正式踏入“可治愈遺傳性疑難雜癥”的新時代。目前，研究團隊正推動“平臺試驗”，旨在針對同類疾病的多個突變開發(fā)快速編輯方案，讓個體化治療從“個案”走向“可復制模式”。

圖1.個體化CRISPR基因編輯療法重大突破文獻來源

Cas9 Nuclease來源于野生型釀膿鏈球菌S. pyogenes，是依賴RNA介導的內切核酸酶，可以特異地切割雙鏈DNA（在DNA PAM存在的情況下，也可以切割單鏈DNA或單鏈RNA）。Cas9切割位點位于目標序列內，離PAM（NGG）區(qū)3個堿基。本產品經過密碼子優(yōu)化及核定位信號（NLS）設計，由大腸桿菌重組表達而來，編輯效率高，可用于細胞（造血干細胞、T細胞等）的基因修飾，也可用于分子診斷，檢測病原體等。

A：體外切割測試：3批次體外切割活性均達98%以上。
B：體內基因敲除，敲除效率與進口品牌一致。

圖2.Cas9 Nuclease體外切割活性及基因敲除效率結果

ArCas12a核酸內切酶，源自Agathobacter rectalis細菌的CRISPR系統(tǒng)，別名Cpf1，是一個包含1263個氨基酸的單體蛋白。Cas12a缺乏HNH結構域，可單獨利用其RuvC結構域在CRISPR RNA（crRNA）引導下識別位于靶標核酸5’端富含胸腺嘧啶（T）的PAM區(qū)而啟動對靶標DNA的切割，已成功用于許多哺乳動物和植物的基因組編輯。此外Cas12a還具有反式切割活性，可不加選擇地切割反應體系中的非靶標單鏈DNA。與LbCas12a/AsCas12a相比，ArCas12a具有更高的溫度適應性（25-55℃），可適用于基因組編輯及核酸檢測等。

圖3.ArCas12a順式切割活性檢測 M：Marker；C：模板雙鏈DNA

注：在crRNA的引導下可高效的切割雙鏈DNA（600 bp）產生兩段切割產物（200 bp+400 bp）

圖4.ArCas12a反式切割活性檢測

注：以雙鏈DNA模板為靶標，加入ArCas12a、crRNA（存在與模板DNA序列互補的spacer區(qū)）及單鏈DNA報告探針（含有熒光報告基團）進行體外切割，當ArCas12a與crRNA及靶標DNA形成復合體后會激活反式切割活性，切割單鏈DNA報告探針，從而發(fā)出熒光。結果顯示，翌圣ArCas12a與crRNA及模板DNA形成復合體后具有反式切割活性，可剪切單鏈DNA。

AapCas12b核酸酶（又名C2c1）是由tracrRNA:crRNA（或sgRNA）介導的DNA核酸內切酶，來源于嗜酸耐熱菌Alicyclobacillus acidophilus，在靶標雙鏈DNA存在PAM（TTN）序列的情況下，特異地剪切靶標雙鏈DNA，使DNA雙鏈斷裂并生成粘性末端。AapCas12b可不依賴PAM序列特異地剪切單鏈DNA靶標。雙鏈或單鏈DNA靶標均能激活AapCas12b的反式剪切活性（即旁路剪切活性/附屬剪切活性），即當AapCas12b酶與sgRNA、靶標DNA結合形成三元復合物后，便會被激活針對非特異序列ssDNA的反式剪切活性，將體系中的任意序列ssDNA切碎。AapCas12b最佳剪切反應溫度為60℃，比AacCas12b更耐高溫，適用于與LAMP聯(lián)用，開發(fā)恒溫擴增/CRISPR-Cas檢測體系。

圖5.AapCas12b Nuclease (10 μM)順式切割活性驗證

注：在20 μL的反應體系，含有帶PMA序列的雙鏈Target DNA、sgRNA、Cas12b和1×reaction buffer，在60°C下反應30 min，85°C下滅活5 min，在瓊脂糖凝膠電泳測定結果顯示，三批次AapCas12b Nuclease (10 μM) (Cat#14808ES)均能有效切割雙鏈Target DNA,切割效果與進口品牌T*相當。

圖6.AapCas12b Nuclease (10 μM)反式切割活性驗證

注：在20 μL的反應體系，含有帶PMA序列的雙鏈Target DNA、sgRNA、Cas12b、Report ssDNA熒光探針和1×reaction buffer，在60℃反應1h，每30 sec采集一次熒光信號，結果顯示在Target DNA、sgRNA、Cas12b共同存在的情況下，Report ssDNA熒光探針能被切割，從而釋放熒光信號。

該試劑盒的應用極為簡便，用戶只需設計一條特定的上游引物，并結合試劑盒提供的其他試劑，即可在短短4小時內合成出20-100 μg高品質的sgRNA。所產生的sgRNA具備高產量、高純度和高活性等優(yōu)勢，在基因編輯過程中能顯著提升編輯效率，并大幅降低脫靶現(xiàn)象的發(fā)生幾率，確保基因編輯工作以高效率和高準確性進行。

圖7.不同時間的sgRNA的合成量

圖8.不同序列的sgRNA的合成產量

圖9.合成的sgRNA的純度（安捷倫2100測定）

圖10.sgRNA的剪切效率效果圖

當前，CRISPR基因編輯技術正處于快速發(fā)展的時期，整個領域仍在不斷成熟和完善中。隨著科學研究和技術應用的持續(xù)推進，我們有理由相信未來將涌現(xiàn)出更多創(chuàng)新性的基因編輯工具，這些新工具將進一步拓寬該技術的應用場景與潛力。

如果您對基因編輯有任何需求或興趣，歡迎隨時聯(lián)系我們。無論是在基礎研究、藥物開發(fā)、農業(yè)生物技術、合成生物學等領域，我們都致力于為您提供前沿的技術支持和服務，共同探索基因編輯帶來的無限可能。

參考文獻

[1] Musunuru K, Grandinette S A, Wang X, et al. Patient-Specific In Vivo Gene Editing to Treat a Rare Genetic Disease[J]. New England Journal of Medicine, 2025.

[2] Kretzschmar K, Watt F M. Lineage tracing[J]. Cell, 2012, 148(1): 33-45.

[3] Hsu Y C. Theory and practice of lineage tracing[J]. Stem Cells, 2015, 33(11): 3197-3204.

Chen C, Liao Y, Zhu M, et al. Dual-nuclease single-cell lineage tracing by Cas9 and Cas12a[J]. Cell Reports, 2025, 44(1).