晝夜節(jié)律廣泛存在于地球上的生物體中，在生物體響應(yīng)環(huán)境的晝夜變化、維持生理穩(wěn)態(tài)和健康中發(fā)揮著重要作用。晝夜節(jié)律紊亂可能會引發(fā)睡眠障礙、免疫力下降等疾病，威脅到人類健康。

在20世紀(jì)90年代，研究發(fā)現(xiàn)并提出，在晝夜節(jié)律的分子機制中，生物鐘（circadian clock）扮演著極其關(guān)鍵的角色。生物鐘是生物體內(nèi)調(diào)控生理和行為節(jié)律（約24小時周期）的核心機制，它通過轉(zhuǎn)錄-翻譯負(fù)反饋環(huán)路（transcription–translation feedback loop，TTFL）的形式實現(xiàn)計時功能，此分子機制在真核生物中高度保守。

（1）轉(zhuǎn)錄因子與DNA啟動子區(qū)域的順式元件結(jié)合，激活靶基因（包括自身抑制因子）的表達；

（2）抑制蛋白在胞質(zhì)中積累并轉(zhuǎn)位至細胞核；

（3）核內(nèi)抑制蛋白與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，抑制其自身轉(zhuǎn)錄，形成約24小時的周期性振蕩。

這種TTFL模型，在多種真核生物鐘系統(tǒng)中具有普遍適用性。但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)該TTFL模型面臨諸多挑戰(zhàn)：①雖然該TTFL模型機制在真菌、植物和動物等不同物種中表現(xiàn)出相似的結(jié)構(gòu)特征（結(jié)構(gòu)保守），但分子組成成分缺乏同源性（獨立進化），暗示可能來源于不同的起源。②轉(zhuǎn)錄和翻譯過程需要消耗細胞約75%的能量，TTFL模型如何克服能量代謝障礙來維持高度有序的晝夜節(jié)律振蕩，目前還沒有解釋清楚。因此，研究試圖尋找并解釋真核生物鐘的分子機制，并探究真核生物與原核生物鐘的潛在共同特征。

文章揭示了P-loop NTP酶家族成員（AAA+（ATPases Associated with diverse cellular Activities））RUVBL2（又名RuvB-like 2）是真核生物中保守的時鐘成分，是真核生物鐘的共同核心成分，闡述了RUVBL2通過能量依賴的NTP酶活性調(diào)控生物鐘的分子機制，并證實了其在真核生物晝夜節(jié)律系統(tǒng)中具有進化保守的核心調(diào)控功能。與藍藻生物鐘核心蛋白KaiC類似，RUVBL2表現(xiàn)出穩(wěn)定的低活性ATP酶特性，其催化效率（約13個ATP分子/天），較常規(guī)ATP酶（103-10?個ATP分子/天）顯著降低。這一發(fā)現(xiàn)也支持了最初在藍藻中發(fā)現(xiàn)的“緩慢ATP酶活性是生物鐘共同特征”的這一觀點。

圖2.循環(huán)振蕩系統(tǒng)的起源模型。該示意圖顯示了所研究的每個生物體的起源，起源于最后一個普遍共同祖先（LUCA）。周期長度受KaiC或RUVBL ATP酶活性的調(diào)節(jié)（論文鏈接：doi.org/10.1038/s41586-025-08797-3）

提出全新假設(shè)：在遠古生命起源階段，隨著原始生物鐘的出現(xiàn)，低活性的 P-loop ATP 酶成為生物鐘系統(tǒng)的核心組件。在藍藻中，KaiC 結(jié)合 KaiA 和 KaiB 組成了一個連接到 TTFL 的強大振蕩器，而在真核生物中，含有 P 環(huán)的 AAA+ ATP 酶 RUVBL2 及其同源蛋白通過與 TTFL 生物鐘蛋白相互作用，參與生物鐘調(diào)控。KaiC 和 RUVBL2 極低的 ATP 酶活性共同決定了生物鐘的 24 小時節(jié)律振蕩，這一機制或許是生物鐘系統(tǒng)進化的共同特征。研究團隊并對這一假設(shè)進行一系列的實驗設(shè)計和論證。

• 免疫共沉淀（Co-IP）與蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，RUVBL2與生物鐘核心復(fù)合物（如CLOCK/BMAL1、PER/CRY）存在物理相互作用。

• 染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）分析RUVBL2對CLOCK/BMAL1靶基因（如Per、Cry）啟動子結(jié)合的調(diào)控，RUVBL2通過維持時鐘蛋白復(fù)合物的動態(tài)組裝（如促進PER/CRY降解或CLOCK/BMAL1的激活），直接調(diào)控TTFL的周期性振蕩。

• RUVBL2的NTP酶活性可能作為細胞內(nèi)能量狀態(tài)的傳感器，將代謝信號（如ATP/ADP比率）與生物鐘調(diào)控偶聯(lián)，解釋生物鐘如何響應(yīng)營養(yǎng)或能量脅迫。

研究團隊通過系統(tǒng)性遺傳篩選，獲得了RUVBL2的三種功能突變體：節(jié)律紊亂型、周期縮短型、周期延長型。將這些突變體通過腺相關(guān)病毒載體遞送至小鼠視交叉上核（SCN）后，可顯著改變其自主運動活動的晝夜節(jié)律模式。

生化分析證實這些表型變異均與ATP酶活性改變直接相關(guān)。酶動力學(xué)分析表明，野生型RUVBL2的ATP水解活性極低，每日僅催化約13個ATP分子水解，其周轉(zhuǎn)率較典型ATP酶顯著降低。

RUVBL2 作為保守的低活性 ATP 酶，在調(diào)控真核生物鐘周期方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用，在人類、果蠅和真菌等不同真核生物鐘系統(tǒng)中均得到驗證：①RUVBL2直系同源物與各物種核心時鐘蛋白存在保守的物理相互作用；②跨物種的RUVBL2突變均導(dǎo)致一致的節(jié)律表型。

使用抗癌藥物 CB-6644 抑制 RUVBL2 活性，可劑量依賴性延長晝夜周期，為新型生物鐘調(diào)節(jié)劑的開發(fā)提供新的方向。

綜上所述，該研究不僅確立了RUVBL2在真核生物晝夜節(jié)律系統(tǒng)中的核心地位，證實了 RUVBL2 作為核心生物鐘組分的作用，也揭示了慢速ATP酶活性這一最初在藍藻時鐘中發(fā)現(xiàn)的特征性機制，如何以類似 KaiC 的機制調(diào)節(jié)真核生物的晝夜節(jié)律，證實了其在真核生物中同樣具有進化保守性，為理解生物鐘的分子進化提供了新視角。

這一發(fā)現(xiàn)豐富了真核生物鐘的分子調(diào)節(jié)機制，深化了對生物鐘能量耦合機制的理解，也為靶向晝夜節(jié)律紊亂的干預(yù)策略提供了新思路，在進化生物學(xué)和生物鐘研究領(lǐng)域具有重要意義。

將野生型或突變的同源基因組克隆至攜帶潮霉素B抗性（# 60225ES，Yeasen Biotechnology）的PBS質(zhì)粒中，該質(zhì)粒攜帶潮霉素B基因，用于后續(xù)篩選。