羅氏LightCycler® 96 實時熒光定量PCR儀系統詳解

一、引言

隨著分子生物學技術的發展，實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative PCR，qPCR）已成為基因表達分析、病原檢測、突變篩查等領域的重要工具。羅氏公司開發的LightCycler® 96 實時熒光定量PCR儀憑借其四通道檢測能力、靈活的實驗設置以及友好的軟件界面，在科研和臨床實驗室中得到廣泛應用。本文將從儀器構造、工作原理、技術特點、應用場景、操作流程及維護要點等方面，系統介紹該設備的性能與使用方法。

二、設備概述

LightCycler® 96 是一款中通量的實時熒光定量PCR儀，可容納96孔標準板，適合日常分子生物學實驗的需求。該系統集成了溫控模塊、光學檢測系統、控制系統與數據分析平臺，能夠實現快速、準確的qPCR擴增與實時數據采集。

主要構成包括：

• 溫控模塊：采用帕爾貼元件（Peltier-based system）進行升降溫控制，溫度梯度小，確保各孔間的溫度均一性。

• 光學檢測系統：搭載四個熒光通道（常用為FAM、HEX、ROX、Cy5），配有獨立的激發與檢測光路，支持多重檢測。

• 操作界面：通過USB或局域網連接PC，配套LightCycler® 96軟件進行程序設置與數據分析。

三、技術參數

四、工作原理

LightCycler® 96 的工作流程遵循標準的實時熒光PCR過程，其核心為：

1. 模板擴增：在熱循環條件下，由特異性引物、探針、酶等反應組分合成目標DNA。

2. 熒光監測：熒光染料與擴增產物結合，熒光強度隨著擴增進行而增強，系統實時記錄每個循環的熒光值。

3. Ct值計算：軟件自動識別熒光信號達到閾值時的循環數，生成Ct（Cycle threshold）值。

4. 定量分析：通過標準曲線法或ΔΔCt法對未知樣品進行相對或絕對定量。

五、關鍵特性與優勢

1. 精準的溫度控制

LightCycler® 96 的溫控模塊采用多點溫度傳感器和閉環控制算法，保障各孔間溫差控制在±0.2°C以內。熱循環效率高，縮短實驗總耗時。

2. 多通道熒光檢測系統

四個熒光通道可同步采集不同染料信號，適合SYBR Green法和TaqMan探針法的單重或多重PCR實驗。每個通道設有獨立激發與發射濾光片，避免通道間信號干擾，提高檢測靈敏度和特異性。

3. 軟件智能化分析

LightCycler® 96配套軟件界面簡潔直觀，提供圖形化編程與數據分析功能，包括：

• 實時擴增曲線、熔解曲線圖

• Ct值自動計算

• 標準曲線生成與效率評估

• 多重擴增數據整合

此外，軟件支持批量數據導出，便于后續統計分析與報告撰寫。

4. 開放性實驗設置

支持用戶自定義擴增程序與檢測方案，適用于多種應用需求?？蛇M行末端熔解曲線分析，用于鑒定引物特異性與判斷非特異擴增產物。

六、典型應用場景

1. 基因表達定量

通過反轉錄實時PCR（RT-qPCR）技術，研究目標基因在不同處理組、時間點或組織中的表達差異。

2. 病原體檢測

快速檢測病毒、細菌、真菌等病原體DNA/RNA，包括新發傳染病的快速篩查（如新冠病毒、甲型流感等）。

3. 基因多態性與突變分析

結合TaqMan探針或熔解曲線分析技術，識別單核苷酸多態性（SNP）與點突變。

4. 拷貝數變異分析

適用于腫瘤基因擴增、拷貝數異常分析，輔助診斷與藥物靶點篩選。

七、操作流程簡述

1. 反應體系配制：按實驗方案準備引物、探針、酶等反應組分，分裝于96孔板中。

2. 程序設置：在軟件中設定熱循環參數，包括初始變性、退火、延伸步驟及熒光采集通道。

3. 加載樣品：將PCR板封膜后置于儀器托盤內。

4. 啟動實驗：點擊運行按鈕后，系統自動執行熱循環并采集實時熒光信號。

5. 數據分析：實驗結束后，使用軟件生成擴增曲線、計算Ct值、進行定量分析或熔解曲線判斷。

八、儀器維護與注意事項

為確保設備長期穩定運行，應定期進行以下操作：

• 清潔光學模塊：用無塵布擦拭樣品托盤，避免熒光通道污染。

• 校準溫控系統：使用標準板驗證溫控均一性，必要時進行系統校準。

• 軟件升級與備份：定期檢查軟件更新，導出重要實驗數據防止丟失。

• 防止冷凝水進入儀器：實驗過程中避免樣品板冷凝水倒流。

九、發展趨勢與展望

隨著分子診斷技術的發展，實時PCR儀器正朝向多通道、高通量、小型化與自動化方向演進。LightCycler® 96 在提供可靠數據基礎上，若結合自動加樣系統、生物信息分析平臺等，將更好地滿足精準醫學、環境監測、食品安全等多場景應用。

十、結語

羅氏LightCycler® 96 實時熒光定量PCR儀以其穩定的性能、友好的軟件操作體驗以及多種兼容的實驗方案，為分子生物學實驗提供了可靠的技術平臺。盡管在通量和自動化程度上尚有拓展空間，但作為科研與教學實驗室的常規工具，其表現足以支撐日常分析任務。未來，結合上游核酸提取與下游數據解讀系統的整合，qPCR平臺的智能化水平有望進一步提升。