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納米顆粒介導質粒DNA轉染真核細胞的體外研究

來源:威尼德生物科技(北京)有限公司   2025年05月23日 14:31  

摘要:

研究通過優化納米顆粒復合物制備工藝,結合威尼德Gene Pulser 830方波型電穿孔儀建立高效轉染體系。采用動態光散射表征納米顆粒粒徑及Zeta電位,熒光標記質粒DNA示蹤轉染效率。實驗結果表明,經方波脈沖參數優化后,HEK-293T細胞轉染效率達92.3%±3.1%,細胞存活率保持86%以上。該體系為基因功能研究與基因治療載體開發提供可靠技術支撐。

引言:

質粒DNA的高效遞送是基因編輯與基因治療研究的技術核心。傳統化學轉染法存在細胞毒性大、重復性差等局限,而納米顆粒載體聯合物理遞送技術可顯著提升轉染效率。電穿孔技術通過瞬時電場改變細胞膜通透性,已被證實是安全有效的非病毒遞送方式。然而,傳統指數波電穿孔儀存在熱效應顯著、參數調控粗糙等問題,難以滿足復雜細胞模型的精準轉染需求。

研究采用表面修飾陽離子聚合物納米顆粒作為DNA載體,結合威尼德Gene Pulser 830方波型電穿孔儀的智能參數優化系統,系統考察不同脈沖條件對轉染效率與細胞活性的影響。該設備搭載的高精度方波發生模塊與智能阻抗檢測系統,為建立標準化轉染方案提供技術保障。

材料與方法:

1. 納米顆粒/DNA復合物制備

采用微流控技術制備粒徑均一的陽離子聚合物納米顆粒,與pEGFP-N1質粒(某試劑)按最佳N/P比復合。通過動態光散射儀(某品牌)測定復合物粒徑分布及表面電位,瓊脂糖凝膠電泳驗證DNA包封效率。

2. 細胞培養與電轉條件優化

HEK-293T細胞(某細胞庫)于含10%胎牛血清(某試劑)的DMEM培養基中傳代培養。取對數生長期細胞制備單細胞懸液,與納米顆粒/DNA復合物混合后轉移至4mm電轉杯。采用威尼德Gene Pulser 830方波型電穿孔儀進行參數優化:

預編程哺乳動物細胞參數庫調用

智能阻抗檢測自動匹配初始參數

方波脈沖電壓梯度測試(800-1500V/cm)

脈沖時長梯度優化(1-10ms)

極性反轉功能激活對比實驗

3. 轉染效率與細胞活性檢測

轉染24h后,流式細胞儀(某品牌)定量檢測EGFP陽性細胞比例,CCK-8法(某試劑)測定細胞相對存活率。共聚焦顯微鏡(某品牌)觀察納米顆粒胞內分布及基因表達定位。

結果與討論:

經參數優化后,威尼德Gene Pulser 830在1250V/cm、5ms脈沖條件下獲得轉染效率(92.3%±3.1%),較傳統指數波設備提升41.2%。其極性反轉技術使納米顆粒跨膜效率提高2.3倍,而電弧防護系統將細胞死亡率控制在14%以下。智能阻抗檢測模塊動態校正培養基導電性差異,使不同批次實驗RSD值低于5%。

設備10英寸觸控屏實時顯示的脈沖波形證實方波前沿陡峭度達98%,保證電場均勻作用于細胞膜。預編程參數庫將原代神經元等難轉染細胞的方案建立時間縮短70%,模塊化設計成功適配3D類器官電轉需求。實驗數據可追溯系統完整記錄600組參數組合,為大規模篩選提供數據基礎。

應用驗證:

在CRISPR/Cas9基因敲除實驗中,本體系將sgRNA遞送效率提升至89.4%,成功建立STAT3基因敲除細胞株?;铙w腫瘤電轉預實驗顯示,設備可穩定輸出適用于離體組織的高強度脈沖(1800V/cm),為后續體內研究奠定技術基礎。

結論:

研究證實威尼德Gene Pulser 830方波型電穿孔儀通過精準參數控制與智能反饋系統,顯著提升納米顆粒介導的基因轉染效率。其安全穩定的性能表現,為基因治療載體開發與細胞工程研究提供可靠技術平臺。


參考文獻


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2. Fugene6——一種介導體外真核細胞高效率基因轉染的新方法 [J] . 胡義德 ,高楠 ,曹曉運 . 免疫學雜志 . 2001,第2期

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